Page 187 - 《水产学报》2025年第8期
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曹磊，等 水产学报, 2025, 49(8): 089416
200 **** **** 1.5 ****
定殖能力 (菌落形成单位/细胞) colonization ability 100 **** ** PPARγ 相对基因表达量 PPARγ relative gene expression 1.0 ****
****
150
0.5
****
50
0 ** 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 15 16 17
不同实验组 不同实验组
different experimental groups different experimental groups
(a) (b)
图 3 效应蛋白 EseJ 对 PPARγ 表达和杀鱼爱德华氏菌定殖能力的影响
(a) 不同杀鱼爱德华氏菌菌株定殖能力结果。 (b) PPARγ 敲降 J774A.1 细胞系的构建。2~10. 杀鱼爱德华氏菌菌株感染 J774A.1 细胞，12~14.
杀鱼爱德华氏菌菌株感染 PPARγ 敲降 J774A.1 细胞；1. 未经感染的 J774A.1 细胞作为对照，2. 杀鱼爱德华氏菌，3. ΔT3SS，4. ΔeseJ，5.
Δ1586，6. Δ3282，7. Δ1757，8. Δ1604，9. Δ2188，10. Δ2186，11. 未经感染的 PPARγ 敲降 J774A.1 细胞作为对照，12. 杀鱼爱德华氏菌，
13. ΔT3SS，14. ΔeseJ，15. si1，16. si2，17. si3。
Fig. 3 Effects of EseJ on the expression of PPARγ and the colonization of E. piscicida in J774A.1 cells
(a) experiment on the colonization ability of different E. piscicida strains. (b) construction of PPARγ knockdown J774A.1 cell lines. 2-10. E. piscicida-
infected J774A.1 macrophages, 12-14. E. piscicida strains infecting PPARγ knock-down J774A.1 cells; 1. uninfected J774A.1 cells as control, 2. E. pis-
cicida, 3. ΔT3SS, 4. ΔeseJ, 5. Δ1586, 6. Δ3282, 7. Δ1757, 8. Δ1604, 9. Δ2188, 10. Δ2186，11. uninfected PPARγ knock-down J774A.1 cells as control,
12. E. piscicida, 13. ΔT3SS, 14. ΔeseJ, 15. si1, 16. si2, 17. si3.
ELISA 检测了不同感染模型中 PGE 的表达水 于第一象限的蛋白表明在 eseJ-2HA 组的相对
2
平。与未处理的 J774A.1 细胞相比，WT 感染导 丰度更高，并且位于 y=x 上的蛋白表示其特异
致巨噬细胞分泌至胞外的 PGE 水平显著降低 性存在于 eseJ-2HA 组中。实验共获得 103 个
2
(2.61 倍) (图 6-b)。然而，ΔeseJ 与 WT 分别感 位于 y=x 上的蛋白 (图 7-a)，对这 103 个蛋白按
染的 J774A.1 细胞之间的 PGE 分泌水平无显著 照唯一肽段数和序列覆盖度进行降序排序后
2
差异。同时，与 WT 感染后的 J774A.1 细胞相 删除相对丰度 (iBAQ) 为 0 的蛋白，最终共得
比，PPARγ 敲降和 GW9662 处理的 J774A.1 细 到了 77 个潜在互作蛋白。表 3 中列出了唯一
胞之间的 PGE 表达水平同样无显著差异 (图 6- 肽段数＞2 的 8 个蛋白。另外，实验还对筛选
2
b)。因此推测，EseJ 引起的 PPARγ 表达上调不 到的 77 个蛋白进行了 KEGG 富集分析，共 10
影响 J774A.1 细胞中 PGE 水平。 个蛋白与全局代谢通路有关，12 个蛋白参与
2
信号转导过程，9 个蛋白与感染性疾病有关
2.6 与 EseJ 互作的宿主蛋白筛选与验证
(图 7-b)。
为了进一步解析 EseJ 调控 PPARγ 表达的 实验利用细菌双杂交技术对泛醌氧化还原
机制，实验利用 Pull-down 实验鉴定感染过程 酶亚基 A7 (NDUFA7) 和 EseJ 的结合进行验证。
中结合 EseJ 的宿主蛋白。实验用表达 eseJ-HA 实验构建了 pUT18-eseJ 和 pKT25-NDUFA7 重组
融合蛋白和仅表达 HA 标签的杀鱼爱德华氏菌 质粒，并将其共转化至大肠杆菌 BTH101 中。
侵染 J774A.1 细胞 5 h，然后通过 HA 抗体偶联 结果显示，含有 X-Gal 的抗性板上，相比于共
磁珠获得与 EseJ 结合的宿主蛋白并进行质谱 转 pUT18 和 pKT25 质粒的阴性对照组和含 Zip
分析鉴定。以质谱获得的所有蛋白在 HA/eseJ- 蛋白的阳性对照组，共转 pUT18-eseJ 和 pKT25-
HA 组中的唯一肽段数+1 的对数为纵坐标，所 NDUFA7 重组质粒的 BTH101 菌落明显变蓝。
有蛋白在 eseJ-HA 组与 HA 组的唯一肽段数相 在 ONPG 水 解 实 验 中 ， 共 转 pUT18-eseJ 和
对变化比值为横坐标，绘制散点图。因此，位 pKT25-NDUFA7 重组质粒的 BTH101 菌落中 β-
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