Page 183 - 《水产学报》2025年第8期

曹磊，等 水产学报, 2025, 49(8): 089416

样并点样到 12% SDS-PAGE 凝胶 [ 生工生物工 500 μL 稀 释 后 的 溶 液 和 1 滴 NucBlue™ Live
程 (上海) 股份有限公司 ]，于 140 V 电压下电 ReadyProbes™试剂 (Thermo Fisher Scientific，美
泳 50 min，然后将蛋白样品转移到 PVDF 膜 国)，于 37°C 孵育 30 min，洗涤后用荧光共聚
(Millipore，美国)。转膜后，使用含 5% 牛血清 焦显微镜观察染色结果。分别计算 ROS 荧光强
白蛋白和 0.05% TBS-Tween20 (TBST) (Epizyme， 度、脂滴荧光强度以及细胞核荧光强度，然后
美国) 封闭 2 h，然后在室温下与 PPARγ 抗体 用 ROS 和脂滴的荧光强度分别除以细胞核荧光
(A11183) 和 Actin 抗体 (AC038，ABclonal，中 强度，得到平均荧光强度值。

国) 孵育 2 h。用 PBST 洗膜后再与 1∶2 000 稀
1.8 mtDNA 的提取与定量
释 的 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 体 (AS014，
使用洋地黄苷法从感染后的 J774A.1 细胞
ABclonal，中国) 在室温下孵育 2 h。最后使用
[21]
中提取线粒体 DNA (mtDNA) 。将离心收集的
PBST 洗膜后进行显色。

细胞用洋地黄苷缓冲液 (150 mmol/L 氯化钠、
1.5 细菌定殖检测
50 mmol/L HEPES 和 25 μg/mL 洋地黄苷) 处理
J774A.1 细胞提前一天接种于 24 孔培养板， 10 min。随后 16 000 × g 离心 25 min 取上清液
5
每孔密度约为 6×10 个细胞。将杀鱼爱德华氏 得到 mtDNA。同时，使用 SPARKeasy 组织/细
菌以 10∶1 的感染复数 (MOI) 感染 J774A.1 细 胞 DNA 试剂盒 (山东思科捷生物技术有限公司)
胞，随后在 35°C Opti-MEM 培养基 (Gibco，美 从细胞沉淀中提取核 DNA (nucDNA)，并进行
国) 中培养 5 h。将感染后的细胞用洗涤，加入 核酸定量。
500 μL 含 1% (体积比) TritonX-100 的磷酸盐缓 通过 qRT-PCR 扩增线粒体基因 (16S rDNA
[22]
冲溶液 (PBS)，振荡 10 min 以彻底裂解细胞。 和 ND4) 和核基因 (PMP22) ，引物见表 2。以
所得裂解后上清用 PBS 按照 10 、10 、10 、10 4 PMP22 基因作为参考对照，使用 2 −ΔΔCt 方法计
1
2
3
5
和 10 倍的稀释倍数进行梯度稀释，取 0.5 μL 算 靶 基 因 的 相 对 表 达 水 平 。 通 过 mtDNA /
不同稀释倍数的稀释液滴于含有多黏菌素的固 nucDNA 计算得到 mtDNA 拷贝数，使用对照组
体 LB 平板上，置于 30°C 培养箱中过夜培养， 进行标准化。

待菌落长出后进行计数。
1.9 酶联免疫吸附测定法 (ELISA)

1.6 RNA 提取与实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)
使用小鼠前列腺素 E2 (PGE ) ELISA 试剂
2
使用 RNA 提取试剂盒 (R6812, Omega Bio- 盒 (上海江莱生物科技有限公司) 检测细胞培养
Tek，美国) 从不同感染组的 J774A.1 细胞中提 上清液中 PGE 浓度。将感染后 J774A.1 细胞的
2
取 总 RNA。 按 照 试 剂 盒 说 明 ， 使 用 基 因 组 培养物按照说明书进行稀释，加入含有 PGE 2
DNA 吸附柱于 14 000 × g 离心 3 min 去除样品 抗体的 96 孔板中进行孵育，依次添加 PGE 偶
2
中 DNA 污染。通过反转录试剂盒 [ 天根生化科 联物、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和显
技 (北京) 有限公司 ] 逆转录产生 cDNA 模版， 色底物 TMB。在酶标仪中读取 OD 0 值并绘制
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使 用 MonAmp™ SYBR Green qRT-PCR Mix 标准曲线，计算样品中 PGE 的浓度。
2

(Low ROX) (莫纳生物科技有限公司) 进行 qRT-
1.10 蛋白下拉实验 (Pull-down)
PCR 上机。使用 β-actin 基因为参照，按 2 −ΔΔCt
构建融合表达 HA 标签多肽的实验菌株
方法计算靶基因的相对转录水平。

(EIB202∆P/eseJ-2HA ) 和 对 照 菌 株 (EIB202∆P/
+
1.7 活细胞染色 +
glms-2HA )。细菌感染后，J774A.1 细胞用预冷
MitoSOX™线 粒 体 超 氧 化 物 指 示 剂 的 PBS 洗涤，去除 PBS 并加入 1 mL 含有蛋白
(Thermo Fisher Scientific， 美 国 ) 和 BODIPY 酶抑制剂 (Roche，瑞士) 的裂解缓冲液 (Thermo
581/591 C11 染料 (Thermo Fisher Scientific，美 Fisher Scientific，美国)。然后将细胞裂解液转
国) 分别用 PBS 稀释至 500 nmol/L 和 2 μmol/L。 移至 EP 管中。待细胞完全裂解后用 BCA 蛋白
针对不同感染组的 J774A.1 细胞，每孔加入 定量试剂盒 [ 生工生物工程 (上海) 股份有限公

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