Page 184 - 《水产学报》2025年第8期

曹磊，等 水产学报, 2025, 49(8): 089416

司 ] 检测样品蛋白浓度，并用 IP 裂解缓冲液将 ΔT3SS 突变株感染的 J774A.1 细胞内 PPARγ 表
所有样品稀释至相同浓度。接着加 40 μL Anti- 达量并未出现大幅增加。在感染 1、3、5 和
HA 磁珠 (货号 11846；CST，美国) 至 EP 管中， 8 h 后 采 集 的 样 本 中 ， 感 染 ΔT3SS 突 变 株 的
4°C 过夜孵育。洗涤后将 EP 管放置于磁力架上， J774A.1 细胞中 PPARγ 的表达水平显著低于感
去除上清液后用 40 μL HA 肽 (Roche，瑞士) 溶 染 WT 的 J774A.1 细胞 (图 1-a, b)。在感染5 h 后，

液竞争性洗脱磁珠上的结合蛋白。4°C 离心收 感染 WT 的 J774A.1 细胞与感染 ΔT3SS 突变株
集上清液，通过质谱鉴定其中蛋白。质谱数据 的 J774A.1 细胞内 PPARγ 表达差异最为显著
在 ProteomeXchange Consortium 数据库 [23-24] 的登 (14.91 倍, P ＜ 0.000 1) (图 1-a,b)。因此，在后
录号为 PXD057603。 续实验中，我们选择感染杀鱼爱德华氏菌 5 h

后的 J774A.1 细胞作为后续研究的培养条件。
1.11 细菌双杂交实验
通过同源重组的方式构建含全长 EseJ 和不 2.2 T3SS 效 应 蛋 白 EseJ 对 J774A.1 细 胞 中
PPARγ 表达的影响
同 EseJ 片 段 的 pUT18 重 组 质 粒 。 将 pKT25-
NDUFA7 重组质粒钙转入 DH5α λpir。将 pUT18 病原菌通常利用 T3SS 分泌多种效应蛋白
重组质粒和 pKT25 重组质粒共转化进入 BTH101 实现对宿主细胞的定殖与感染 [26-29] 。为了解析
感受态。准备显色平板：LB 固体培养基+100 T3SS 参与杀鱼爱德华氏菌感染促进 J774A.1 细
μg/mL 羧苄青霉素、50 μg/mL 卡那霉素、0.5 胞中 PPARγ 表达的机制，实验利用已知 T3SS
mmol/L IPTG 和 40 μg/mL X-Gal [ 生工生物工 效 应 蛋 白 的 缺 失 菌 株 (包 括 ΔeseJ、 Δ1 604、
程 (上海) 股份有限公司 ]。将转化子涂布于显 Δ3 282、Δ1 586、Δ1 757、Δ2 186、Δ2 188) 感染
色平板，30°C 倒置培养，48 h 后观察菌落颜色。 J774A.1 细胞，检测其中 PPARγ 水平。结果显
白色菌落表示为不存在互作，蓝色菌落表示为 示 ， 与 感 染 WT 的 J774A.1 细 胞 相 比 ， 感 染
存在互作。通过 β-半乳糖苷酶活性测定通过 ΔeseJ 的 J774A.1 细胞中 PPARγ 的量显著降低
ONPG 水解实验进行。β-半乳糖苷酶活性计算 (2.11 倍，P = 0.020 7)，且下降趋势与感染 ΔT3SS
[25]
公式：1 000 × A 420 / (OD 600 × 0.2 mL ×t min) 。 突变株的细胞内 PPARγ 水平相似 (图 2-a)。此

外 ， 与 感 染 WT 的 J774A.1 细 胞 相 比 ， 感 染
1.12 数据分析
Δ1604、 Δ3282、 Δ1757、 Δ1586 和 Δ2186 缺 失
荧 光 图 像 和 Western blot 灰 度 分 析 使 用
菌株的 J774A.1 细胞中 PPARγ 水平上调约 2 倍，
Image J 软件进行，使用 GraphPad Prism 8.0.1 软
感染 Δ2188 缺失菌株的 J774A.1 细胞中 PPARγ
件进行图片绘制。每组数据进行 3 次生物学重
的水平无显著变化 (图 2-a, b)。
复。显著性分析采用单因素方差分析方法 (One-
为了进一步验证 EseJ 的功能，实验构建
Way ANOVA)。P<0.05 表示具有显著差异。
了 ΔeseJ::eseJ 回补菌株并感染 J774A.1 细胞。

2 结果 结果显示，ΔeseJ::eseJ 回补菌株感染后 J774A.1
细 胞 中 PPARγ 的 水 平 恢 复 到 与 感 染 WT 的

J774A.1 细胞相类似的水平 (图 2-c, d)。上述结
2.1 杀鱼爱德华氏菌感染对 J774A.1 细胞中
果表明，杀鱼爱德华氏菌感染过程中 T3SS 效
PPARγ 表达的影响
应蛋白 EseJ 促进 J774A.1 细胞中 PPARγ 的表达。

为了确定病原菌感染是否引起巨噬细胞中
PPARγ 表达的变化，实验用野生型杀鱼爱德华 2.3 T3SS 效应蛋白调控 PPARγ 表达对杀鱼爱
德华氏菌定殖的影响
氏菌 (WT) 和Ⅲ型分泌系统缺失株 (ΔT3SS) 侵
染 J774A.1 巨噬细胞，于侵染后不同时间点检 病原菌可通过转运多种效应蛋白以重编程
测 PPARγ 的表达水平。与 MOCK 相比，WT 感 宿主细胞的代谢和免疫过程，从而促进定殖感
染显著增加 J774A.1 细胞内 PPARγ 表达量。随 染 过 程 [26-29] 。 为 了 研 究 T3SS 效 应 蛋 白 调 控
着感染时间增加，PPARγ 表达提升幅度从 0 h PPARγ 表达对杀鱼爱德华氏菌感染的影响，首
3.27 倍增加至 8 h 77.16 倍 (图 1-a,b)。然而受 先对 WT、ΔT3SS 以及其他效应蛋白缺失菌株

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