Page 91 - 《中国药科大学学报》2026年第2期

第 57 卷第 2 期 李佳慧，等：载厚朴酚达妥西单抗及三苯基膦双重修饰免疫脂质体对神经母细胞瘤的靶向治疗作用 217

限公司)；多功能酶标仪 (河南领秀仪器有限公司)； 游离的 Mag 混悬液 2 mL 装入透析袋，两端夹住，
流式细胞仪 (厦门福流生物科技有限公司)。 置于 pH 7.4 的 PBS 释放介质中，37 ℃ 恒温，恒速
1.3 细胞和动物 (100 r/min) 搅拌。在预定的时间点取样。 使用
IMR32、 WiDR、 SH-SY5Y 和 SMS-KCNR 细 0.22 μm 微孔膜过滤释放溶液，使用 HPLC 检测
胞均由桂林医科大学细胞培养中心提供。在恒湿 Mag 的含量。 将 Mag/aGD2-T-ILN 混悬液储存在
恒温条件下 (37 ℃，5% CO )，DMEM 培养基被用来 4 ℃ 冰箱中，观察其外观特征，并检测其粒径和
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培养 SH-SY5Y 和 SMS-KCNR 细胞，培养介质包含 Zeta 电位。
胎牛血清及青霉素链霉素补充物。当细胞达到 2.5 细胞毒性试验
70% 汇合时进行实验。 本实验设置 1 个对照组及 3 个药物制剂实验
雄性 BALB/c 裸鼠 (20 ~ 23 g，5 周龄) 购于 组，分别为游离 Mag 组、Mag/LN 组和 Mag/aGD2-
广 西 壮 族 自 治 区 药 品 检 验 研 究 院 ， 合 格 证 号 ： T-ILN 组。各制剂组均设置 5 个 Mag 浓度梯度，依
SCXK(桂)2022-0001。并在无菌环境 (22 ℃，46% 次为 0.01、0.1、1、50 及 100 µmol/L。将 SH-SY5Y
湿度) 中饲养，提供自由饮水和饲料。所有动物实 或 SMS-KCNR 细胞接种后，经上述不同组给药处
验程序均遵守桂林医科大学动物实验伦理委员会 理并培养 24 h，随后更换为含 10% CCK-8 的培养
制定的指南。 基继续孵育 2 h。采用 ELISA 酶标仪测定吸收度，
进而计算细胞抑制率。
2 方 法
2.6 细胞凋亡

2.1 Mag/aGD2-T-ILN 的制备 本实验共设置 4 组：游离 Mag 组、Mag/LN 组、
按最优处方称取磷脂 40 mg、胆固醇 25 mg、 Mag/aGD2-T-ILN 组 (Mag 质量浓度 30 µg/mL) 以
Mag 20 mg、DSPE-PEG2000-aGD2 0.2 mg 和 DSPE- 及对照组。将 SH-SY5Y 细胞分别进行上述各组给
PEG2000-TPP 0.2 mg (或不含上述两者)，将上述物 药处理后，置于适宜条件下培养 48 h。随后，依次
质加入到体积比为 1∶1 氯仿和甲醇有机溶液中完 向细胞悬浮液中加入膜联蛋白 V-FITC 染色溶液
全溶解。采用旋转蒸发器减压下蒸发有机溶剂，真 和 PI 染色溶液，并在避光环境中孵育 5 min。最后
空干燥后脱膜。脂膜经细胞粉碎机超声处理 5 min， 采用流式细胞仪对样品进行检测，并计算细胞总凋
然后通过 0.22 µm 微孔滤膜过滤获得 Mag/aGD2-T- 亡率。
ILN 和 Mag/LN(对照脂质体)。 2.7 细胞结合
2.2 形态、颗粒大小和表面电荷 参照“2.1”项下方法，分别制备 Rho-aGD2-T-
将一滴样品用蒸馏水稀释 100 倍，然后将它 ILN 及 Rho-LN， 仅 在 处 方 中 额 外 添 加 0.02 mg
滴至涂有碳膜的铜网上，2% 磷钨酸溶液负染后自 DSPE-PEG2000-Rho。 将 IMR32(高 GD2 表 达 ) 和
然风干。使用透射电子显微镜 (TEM) 来确定脂质 WiDR(低 GD2 表达) 肿瘤细胞调整至 每毫升 1×10 5
体的形态。将少量干燥样品装载到铝短棒上，溅射 个细胞的浓度，分别用 0.1～1 000 μg/mL 梯度浓度
覆盖金-钯，使用扫描电子显微镜 (SEM) 对样品 的 Rho-aGD2-T-ILN 及 Rho-LN 于培养基中处理，
进行观察。此外，使用激光粒度分析仪 (DSL) 测定 37 ℃ 孵育 2 h。孵育结束后，采用流式细胞仪测定
并记录稀释样品的粒径 (体积直径)、PDI 和 Zeta 细胞悬浮液的荧光强度，分析制剂与不同 GD2 表
电位。 达水平细胞的结合能力。
2.3 包封率和载药量 2.8 细胞摄取
使用葡萄糖凝胶柱色谱分离 Mag/aGD2-T- 用 KCNR 神经母细胞瘤细胞对罗丹明标记的
ILN 和游离药物。采用 HPLC 测定包封在脂质体 aGD2-T-ILN(Rho-aGD2-T-ILN) 进行摄取试验。将
中的 Mag 含量以及 Mag 的总含量。计算包封率和 每毫升 1×10 个的 KCNR 细胞在 37 ℃ 下暴露于玻
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载药量。 璃 底 皿 上 的 Rho-aGD2-T-ILN(1 mmol/L) 中 4 h。
2.4 体外药物释放和稳定性 用 线 粒 体 绿 色 荧 光 探 针 将 细 胞 的 线 粒 体 染 色
将相同剂量的 Mag/aGD2-T-ILN、Mag/LN 和 15 min。随后，使用共聚焦激光扫描显微镜来拍摄