Page 132 - 《中国药科大学学报》2026年第2期

258 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2026, 57(2): 256 − 265 第 57 卷

只 ： 正 常 对 照 组 （ Control） 、 高 脂 饮 食 （ high-fat 2.6 肝脏线粒体 ATP 和膜电位检测
diet，HFD）模型组、AZT 低剂量组（AZT 25 mg/kg） 根据组织线粒体提取试剂盒说明书，大鼠解剖
和 AZT 高剂量组（AZT 50 mg/kg）。除对照组外， 时，取肝脏组织约 30 mg，生理盐水溶液洗涤后置
其余各组均饲喂高 60% 脂肪供能（35% 质量占比） 于 2 mL 离心管中，取材过程及离心管全程置于冰
的谷粮型高脂饲料（江苏协同生物 XTHF60-1）。 上。取材后尽快在 4 ℃ 匀浆 10 次，转移匀浆液于
持续 6 周，其中前 2 周为造模期，后 4 周在继续高 1.5 mL 锥底离心管中，2 500 r/min，4 ℃，离心 5 min
脂饲养的同时进行药物干预。AZT 溶于超纯水配 后取上清液。小心转移上清液至另一套 1.5 mL 锥
制成所需浓度，分别以 25 mg/kg 和 50 mg/kg 剂量 底离心管中，10 700 r/min，4 ℃，离心 10 min 后弃去
灌胃给药，每日 1 次，连续 4 周；对照组与模型组 上清液，沉淀即为分离所得线粒体，加入 PBS 溶液
以等体积超纯水灌胃给药。本实验所有给药体积 1 mL 重悬，即得线粒体待测样品，采用 BCA 法测
均为 10 mL/kg。 定蛋白含量以标准化。根据组织线粒体膜电位试
2.2 血清葡萄糖甘油三酯动态分析实验 剂盒说明书加入探针，酶标仪荧光系统设定双波长
于 AZT 给药干预 2 周后进行禁食动态监测实 （单体激发光 490 nm，发射光 530 nm；聚合物激发
验。大鼠于检测当天 9:00 开始禁食（不禁水），在禁 光 525 nm，发射光 590 nm）检测荧光值并计算线粒
食 0、4、8、12 h 分别经眼眶后静脉丛采集全血。血 体膜电位水平。避光条件下取适量的 ATP 含量检
样收集于 200 μL 离心管中，室温放置 30 min 后， 测试剂 Cell Titer-Glo 2.0 Reagent。黑色 96 孔板样
以 3 500 r/min 离心 15 min。吸取上清血清至新的 品孔中加入线粒体待测样品 50 μL 及 ATP 含量检

200 μL 离心管中，按试剂盒说明书测定血糖及血清 测试剂 50 μL，常温振荡混匀 30 min 后读取化学发
甘油三酯水平。 光值并计算 ATP 水平。
2.3 口服糖耐量试验 2.7 肝脏和脂肪组织质量及组织形态学
于 AZT 给药干预 3 周后进行口服葡萄糖耐量 解剖时，取大鼠腹股沟白色脂肪（inguinal white
试验。大鼠于检测前一晚开始禁食（不禁水），禁食 adipose tissue，iWAT）、附睾白色脂肪（epididymis
12 h 后按体重灌胃 2 g/kg 葡萄糖溶液。分别在灌 white adipose tissue，eWAT）、肝脏，称重，计算脏器
胃 0、15、30、60、120 min 通过眼眶后静脉丛采集 指数，即组织占体重的质量分数。剪取大鼠肝脏大
全血，血样收集于 200 μL 离心管中，在室温放置 叶组织和 eWAT 中间部分，4% 甲醛固定，经石蜡包
30 min 后，以 3 500 r/min 离心 15 min。吸取上清血 埋并切片后，进行苏木精-伊红（HE）染色。随后在
清至新的 200 μL 离心管中，按试剂盒说明书测定血 BX53 正置显微镜下观察并拍照记录。
糖及血清乳酸水平。根据各时间点血糖及血清乳 2.8 肝脏组织 PPAR 信号通路关键蛋白表达检测
酸值计算血糖-时间曲线下面积及乳酸-时间曲线下 采 用 蛋 白 质 免 疫 印 迹 法 检 测 肝 脏 组 织 中
面积。 PPARα、CPT1α 及 PPARγ 的蛋白表达水平。提取
2.4 终点血生化指标检测 肝脏组织蛋白，采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测
大鼠于解剖前一晚禁食过夜（不禁水）。禁 定蛋白含量。蛋白变性后，按照说明书使用（一步
食 12 h 通过眼眶后静脉丛终点取血，血液收集于 制胶法）配制凝胶进行电泳，蛋白上样量为 30 μg，
1.5 mL 离心管中，在室温放置约 30 min。随后以 快速电泳条件设置为恒压 200 V，40 min。随后，冰
3 500 r/min 离心 15 min，吸取上清血清至新的 1.5 mL 浴条件下以恒流 400 mA 将蛋白湿转至 PVDF 膜，
离心管中。按试剂盒说明书测定血糖、血清乳酸、 持续 45 min。转膜完毕后，无蛋白快速封闭液室温
血清甘油三酯等水平。 封闭 30 min。将膜与相应一抗 4 ℃ 孵育过夜。次
2.5 肝脏组织氧化应激和甘油三酯检测 日，用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 min，随后与辣根过
解剖时，取大鼠肝大叶，液氮速冻之后，−80 ℃ 氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠二抗室温孵育 1 h。
冰箱保存。取冻存肝脏组织，常规制备组织匀浆， 经 TBST 再次充分洗涤后，使用 ECL 化学发光试剂
离心取上清液，按照试剂盒说明书，进行氧化应激 盒在凝胶成像仪上曝光显影。用 Image J 软件对目
（SOD、MDA）及甘油三酯水平测定。 标条带进行灰度值分析，以目标蛋白与内参 GAPDH