Page 116 - 《中国药科大学学报》2026年第2期
P. 116

242                      学报   Journal of China Pharmaceutical University 2026, 57(2): 240 − 245  第 57 卷

               磺酸   [4-（2-hydroxyethyl）piperazine-1-ethanesulfonic  收集菌液，弃上清液。向菌体沉淀加入裂解缓冲
               acid，HEPES]（北京索莱宝科技有限公司）；辅酶                      液（10 mmol/L IM，20 mmol/L HEPES、150 mmol/L
               Q0（CoQ0）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；                       NaCl，pH 7.5）30 mL  重悬菌体沉淀。将重悬液置于
               L-氢化乳清酸（DHO）（上海源叶生物科技有限公                         冰浴中，以      250 W  功率超声破碎重悬后的菌体
               司）；小分子化合物          Lyb24（陶术生物科技有限公               30 min，超声条件为：工作        2 s，间歇  3 s。菌体裂解后
               司）；Biacore 8K  高通量分子间相互作用分析系统、                   的样品    8 000 r/min，4 ℃，离心  1 h，收集上清液。取
               CM5 芯片、乙酸钠、乙醇胺、1-乙基-3-（3-二甲氨基                    上清液进行亲和色谱纯化：将上清液以                    2 mL/min
               丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）                      的流速通过      Ni-NTA-Sepharose CL-6B  亲和柱（柱体
               （瑞典   Cytiva 公司）；BioTek 酶标仪（美国        Bio-Rad    积  3 mL），该柱预先依次用以下           3 种平衡缓冲液处
               公司）；微量分光光度计（美国 Biochrom SimpliNano               理：500 mmol/L IM、20 mmol/L HEPES、150 mmol/L
               公司）。                                             NaCl， pH  7.5； ddH O； 10  mmol/L  IM、 20  mmol/L
                                                                                 2
                                                                HEPES、150 mmol/L NaCl，pH 7.5。随后使用分别
                2    方 法
                                                                含有   10、20、50、100、500 mmol/L IM   的洗脱缓冲
                2.1    PyrD  重组蛋白的克隆、表达及纯化                      液（均含    20 mmol/L HEPES、150 mmol/L NaCl，pH
                2.1.1 重组表达质粒的构建和转化 采用基于聚                        7.5）进行分部梯度洗脱：流速              2 mL/min，分部收
               合酶链式反应的精确合成方法获得含有                     NdeⅠ和      集。各洗脱组分用考马斯亮蓝                R-250 染色和十二
               XbaⅠ酶切位点的        pyrD  基因片段。使用        NdeⅠ和      烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电
               XbaⅠ分别对      pyrD  基因片段及     pET-30a（+）进行双       泳对洗脱样品进行检测。

               酶切，酶切体系为:10 × buffer 1 µL，DNA       模板   1 µg，    2.2    SPR  实验
               NdeⅠ和   XbaⅠ（20 000 units/mL）各  0.25 µL，ddH O     2.2.1  仪 器 校 正 与 缓 冲 液 体 系   使 用      Biacore
                                                          2
               补充至 10 µL。37 ℃     条件下孵育      1 h，分别取酶切后         8K  高通量分子间相互作用分析系统进行                   SPR  实
               的  pyrD  基因片段    37.5 ng 及  pET-30a（+）50 ng，2 ×  验。仪器温度设置为           25 ℃。首先以      4.5%  及  5.8%

               buffer  10  µL， T4  DNA  连 接 酶 （ 400 000  units/  mL）  DMSO  校正液建立溶剂校正曲线，用于消除本体折
               1 µL，ddH O 2  补充至  20 µL，16 ℃  条件下孵育过夜           射率差异引起的背景信号。运行缓冲液为含                        5%
               后 在   65  ℃  条 件 下 加 热 灭 活  10  min， 获 得  pET-   DMSO   和  Tween 20 的  PBS（pH 7.4），所有溶液均
               30a（+）-PyrD。                                     经  0.22 µm  滤膜过滤并充分脱气。
                2.1.2  目 的 基 因 的 诱 导 表 达   取    1  µL  经 测 序     2.2.2 PyrD  蛋白固定化 采用标准氨基偶联法将
               验证的    pET-30a（+）-PyrD  质粒（298 ng/µL）转化至         PyrD  共价固定在     Series S CM5 传感器芯片活性通
               100 µL BL21（DE3）感受态细胞，冰浴          30 min，42 ℃    道，以   1∶1 混合的   0.4 mol/L EDC  与  0.1 mol/L NHS
               条件下热激       1 min，立即置于冰上        5~10 min；加入      激活羧基化表面         420 s（流速  30 µL/min），随后注入
               LB  培养基   500 µL，37 ℃、220 r/min 恒温培养      1 h；   0.3 µmol/L PyrD（溶于   10 mmol/L  乙酸钠，pH 4.5）
               取培养物     100 µL  涂布在含有      50 µg/mL  卡那霉素       420 s；最后用    1 mol/L  乙醇胺（pH 8.5）封闭剩余活
               的  LB  琼脂平板上，37 ℃      静置培养过夜。挑取单克               化位点    420 s。参考通道按相同流程激活与封闭，但
               隆菌落接种至含          50 µg/mL  卡那霉素的       100 mL    不偶联蛋白，用于非特异结合校正。
               LB  培养基中，于     37 ℃、220 r/min 条件下培养过夜；            2.2.3 Lyb24 动力学分析 Lyb24 用运行缓冲液
               取  15 mL  过夜培养物加至       1 L  含  50 µg/mL  卡那霉    （5% DMSO + 0.05% Tween 20 + PBS）稀释为      1.56、
               素的   LB  培养基中，37 ℃、220 r/min 的条件下继续              3.12、6.25、12.5、25、50 及   100 µmol/L  梯度浓度，
               培养至菌液      A  0  达到  0.6~0.8，加入  IPTG  至终浓度      依次以    30 µL/min 的流速流经活性通道与参考通道
                           60
               为  0.3 mmol/L，16 ℃、220 r/min 条件下继续培养过            各  100 s，再以缓冲液冲洗       200 s 解离。每轮浓度测
               夜以诱导重组蛋白的表达。                                     定后用    10 mmol/L  甘氨酸-盐酸（pH 2.0）以相同流
                2.1.3  pET-30a（ +） -PyrD  蛋 白 的 纯 化   过 夜       速脉冲    30 s 再生芯片表面。传感图经“参考通道扣
               诱 导 后 ， 在 室 温 条 件 下 ， 4 000  r/min 离 心  8  min   除”及“零浓度空白扣除”双重校正后，使用                   Biacore
   111   112   113   114   115   116   117   118   119   120   121