Page 115 - 《中国药科大学学报》2026年第2期

第 57 卷第 2 期 孙嘉荣，等：小分子化合物 Lyb24 与二氢乳清酸脱氢酶 PyrD 的相互作用研究 241

obtain a high-purity product. Surface plasmon resonance (SPR) experiments were conducted to detect the direct
interaction between Lyb24 and PyrD protein, and a DCIP-based colorimetric assay was used to evaluate the effect
of Lyb24 on the catalytic activity of PyrD. The pET-30a(+)-PyrD plasmid was successfully constructed, and the
recombinant PyrD protein with a molecular weight of approximately 36 kD was expressed and purified to a
−5
concentration of 5.58 mg/mL. Lyb24 exhibited high-affinity direct binding to PyrD (K = 8.83 × 10 mol/L) and
D
exerted an uncompetitive inhibition effect on the catalytic activity of PyrD. This study demonstrates that Lyb24, a
small-molecule compound, directly binds to PyrD and inhibits its enzymatic activity, providing crucial
experimental evidence for developing PyrD-targeted antibacterial agents with value of clinical translation.
Key words Klebsiella pneumoniae; inhibitor; Lyb24; PyrD; mechanism study

This study was supported by Shenzhen Clinical Research Center for Respiratory Disease (LCYSSQ20220823091203007)

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是 本研究通过制备 PyrD 重组蛋白，进一步利用
一种定殖于口腔、鼻咽和胃肠道黏膜表面的革兰氏 表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）
阴性杆菌，具有机会致病性，可引起免疫缺陷患者 技术，首先证实了 Lyb24 可与 PyrD 发生直接结合；

[1]
泌尿道、腹腔、肺部和血流感染 。KP 还是医院呼 进一步，利用酶活实验验证了 Lyb24 对 PyrD 催化
[2]
吸机相关性肺炎的重要病原体之一 。 的嘧啶从头合成途径中 DHO 转化为 OA 过程的抑
碳青霉烯类抗菌药物是治疗 KP 感染的重要 制作用 。本研究的开展，为下一步开发 Lyb24 在
[7]
药物之一，但是随着该类药物的过度使用，KP 对其 抗 CRKP 中的临床应用价值提供了数据支撑。
[3]
耐药率逐年升高 。以亚胺培南和美罗培南为例，
1 材 料
KP 的耐药率分别由 2005 年的 3.0% 和 2.9% 上升
[4]
至 2024 年的 22.6% 和 23.4% 。在 2024 年发布的 1.1 培养基
全球优先病原菌清单中，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌 LB（Luria-Bertani）培养基：称取胰蛋白胨粉末
（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP） 10 g、酵母提取物粉末 5 g 及氯化钠（NaCl）粉末 10 g
已被世界卫生组织列为最优先级的耐药菌，迫切需 溶于去离子水 1 L 中，经 121 ℃ 灭菌 15 min，将其冷
[5]
要研发新型抗生素 。因此，寻找新的针对 CRKP 却至室温，4 ℃ 冰箱保存备用；高压灭菌前加入琼脂
的治疗策略迫在眉睫。 粉 15 g 制备固体培养基，经 121 ℃ 灭菌 15 min，将
PyrD 是嘧啶核苷酸从头合成途径中的关键 其冷却至 50 ℃ 时加入 50 mg/mL 的卡那霉素 1 mL
酶，主要负责催化二氢乳清酸（dihydroortate，DHO） 制备卡那霉素抗性平板。
转化为乳清酸（orotate，OA）。鉴于其在核苷酸合成 1.2 试剂和仪器

过程中的关键作用，PyrD 被认为是开发新型抗生素 大肠埃希菌 Arctic Express 株（上海碧云天生物
的理想靶标。本课题组前期采用热蛋白质组分析 技术有限公司）；DNA 限制性内切酶 NdeⅠ、XbaⅠ
技术（thermal proteome profiling，TPP），比较了 KP 和 T4 DNA 连接酶（纽英伦生物技术公司）；pET-30a
蛋白组在小分子化合物 Lyb24 作用前后的热稳定 （+）（上海纽普生物科技有限公司）；胰蛋白胨

性变化。结果表明，在 1 098 个被鉴定出的蛋白中， （奥克赛德公司）；酵母提取物粉末、NaCl、磷酸盐
有 613 个的热稳定性因 Lyb24 的加入而发生了显 缓冲液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）、亲和色谱柱、
著变化，其中 197 个热稳定性增加，416 个热稳定性 Ni-NTA 6FF（His-Tag）蛋白琼脂糖纯化树脂、三羟
降低。其中，Lyb24 通过与 AzoR 蛋白相互作用而 甲基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，
发挥增效多黏菌素 B 抗 CRKP 的活性已阐明并发 Tris]、乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na ）、聚山梨
2
表相关论文 。在 TPP 实验中，除了 AzoR 外，意外 酯 20（Tween 20）上海生工生物工程有限公司）；硫
[6]
发现嘧啶核苷酸合成途径的关键限速酶 PyrD 的热 酸卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、2，
稳定性也受到了较显著的影响，提示两者可能存在 6-二氯酚靛酚（DCIP）（大连美仑生物技术有限公
[6]
相互作用 。 司）；咪唑（imidazole，IM）、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙