Page 46 - 《中国药科大学学报》2026年第1期

40 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2026, 57(1): 34 − 45 第 57 卷

(Continued) Receptor 选项选择已处理过的蛋白，Input Ligands
Compd. NMR 选项选择已处理过的小分子，Input Site Sphere 选项
15 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.91 (br.s, 1H, 9-NH), 选择前述所定义的活性位点。
7.94 (br.s, 1H, 21-NH 2 ), 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Ar-H), 2.4 体外 酶活性测试实验
7.82 (s, 1H, Ar-H), 7.36 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.32 LDHA
(s, 1H, 21-NH 2 ), 7.23 (t, J = 6.1 Hz, 1H, 11-NH), 4.39 (d, 在细胞中，丙酮酸在 LDHA 的催化下，转化成
J = 6.0 Hz, 2H, 13-CH 2 )
为乳酸，此过程不断消耗 NADH，生成 NAD 。因
+
16 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.98 (br.s, 1H, 9-NH),
7.82 (s, 1H, Ar-H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Ar-H), 7.47 此，NADH 的被消耗速率可以视为底物丙酮酸被
(d, J = 8.0 Hz, 2H, Ar-H), 7.33 (s, 2H, 21- NH 2 ), 7.21 (t, J LDHA 转化为乳酸的速率。NADH 消耗的速率可
= 6.0 Hz, 1H, 11-NH), 4.41 (d, J = 6.0 Hz, 2H, 13-CH 2 )
以通过酶标仪来测定，NADH 在 340 nm 下有特征
17 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.16 (br.s, 1H, 1-OH), +
8.91 (s, 1H, Ar-H), 8.49 (s, 1H, Ar-H), 7.40 (d, J = 4.6 吸收峰，而其氧化产物 NAD 在此波长吸收极弱。
Hz, 4H, Ar-H), 7.39–7.34 (m, 1H, Ar-H), 5.70 (s, 2H, 14- 基于 NADH 的紫外吸收特性，可以计算出 NADH
CH 2 )
的消耗速率。将纯化的 LDHA 5 μL 加入缓冲液
18 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.16 (br.s, 1H, 1-OH),
8.91 (s, 1H, Ar-H), 8.48 (d, J = 1.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.49 （200 mmol/L Tris HCl，pH7.4，100 mmol/L EDTA，
(dd, J = 8.6, 5.6 Hz, 2H, Ar-H), 7.24 (t, J = 8.9 Hz, 2H, 0.01% Tween-20）95 μL 中，配制成 LDHA 缓冲溶液。
Ar-H), 5.70 (s, 2H, 14-CH 2 )
在 96 孔板中，依次加入 LDHA 缓冲溶液 10 μL、测
19 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.16 (br.s, 1H, 1-OH),
8.92 (s, 1H, Ar-H), 8.49 (d, J = 1.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.45 试化合物缓冲溶液 10 μL、NADH 缓冲溶液 70 μL。
(q, J = 8.6 Hz, 4H, Ar-H), 5.71 (s, 2H, 14-CH 2 ) 随后将 96 孔板放入恒温孵育箱中，37 ℃ 下孵育
20 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.16 (br.s, 1H, 1-OH), 5 min，最后加入丙酮酸缓冲溶液 10 μL。保证最终
8.91 (d, J = 2.1 Hz, 1H, Ar-H), 8.48 (s, 1H, Ar-H), 7.61
(d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar-H), 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar-H), 每孔总体积为 100 μL，每孔中 LDHA 蛋白的终浓度
5.70 (s, 2H, 14-CH 2 ) 为 5 nmol/L，NADH 的终浓度为 0.06 mmol/L，丙酮
21 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.16 (br.s, 1H, 1-OH), 酸的终浓度为 0.2 mmol/L。每个化合物每次测量
8.87 (s, 1H, Ar-H), 8.48 (s, 1H, Ar-H), 7.31 (d, J = 8.2
Hz, 2H, Ar-H), 7.20 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 5.64 (s, 3 个复孔并平行进行 3 次实验。在室温（23~25 ℃）
2H, 14-CH 2 ), 2.29 (s, 3H, 22-CH 3 )
下以每 2 秒为单位记录 NADH 的吸收度，共记录 5
22 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.17 (br.s, 1H, 1-OH), min。拟合吸收度与时间图（30~90 s）的合适线性部
8.97 (s, 1H, Ar-H), 8.49 (s, 1H, Ar-H), 7.78 (d, J = 8.1
Hz, 2H, Ar-H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Ar-H), 5.84 (s, 分，并计算斜率以确定反应速率。抑制率=（对照组
2H, 14-CH 2 )
平均斜率–给药组平均斜率）/对照组平均斜率×
23 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.17 (br.s, 1H, 1-OH), 100%。最后使用 GraphPad Prism 8 进行数据分析。
8.94 (s, 1H, Ar-H), 8.49 (s, 1H, Ar-H), 7.54 (d, J = 8.7
Hz, 2H, Ar-H), 7.41 (d, J = 7.7 Hz, 2H, Ar-H), 5.76 (s, 2.5 分子动力学模拟实验
2H, 14-CH 2 )
使 用 GROMACS 2019 进 行 MD 模 拟 ， 使 用
24 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.14 (br.s, 1H, 1-OH), amber14sb-OL15.ff 力场来准备 LDHA 蛋白 。选
[20]
8.94 (s, 1H, Ar-H), 8.49 (s, 1H, Ar-H), 8.00 (br.s, 1H, 22-
NH 2 ), 7.88 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.45 (d, J = 8.2 Hz, 择从 Discovery Studio 2020 中的 CDOCKER 模块
2H, Ar-H), 7.41 (br.s, 1H, 22-NH 2 ), 5.76 (s, 2H, 14-CH 2 )
获 得 的 最 佳 对 接 构 象 作 为 MD 的 初 始 构 象 。
25 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 13.17 (br.s, 1H, 1-OH), Gaussian 16 优化小分子得到合理结构并计算电荷，
8.94 (s, 1H, Ar-H), 8.50 (s, 1H, Ar-H), 7.88-7.81 (m, 2H,
Ar-H), 7.59-7.52 (m, 2H, Ar-H), 7.39 (br.s, 2H, 22-NH 2 ), 生成小分子拓扑文件。使用 pdb2gmx 程序生成蛋
5.81 (s, 2H, 14-CH 2 ) 白的拓扑结构文件，进一步进行复合物拓扑和结构
13
C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ：162.38, 159.30, 148.42,
144.45, 142.28, 139.75, 128.98, 128.87, 126.66, 123.84, 文件整合，将小分子的 top 文件和 gro 文件按类别
53.13
整合至蛋白 top 文件和 gro 文件中，合并原子数为
总原子数量。使用 editconf 程序将复合物置于立方
白复合物晶体结构中原配体的位置为中心，10 Å为 体盒子中，复合物整体距离盒子边界最小距离设置

半径构建活性位点。其余参数保持默认。 为 1 nm。使用 solvate 程序添加水分子，genion 程
（4）分子对接：使用 Receptor-Ligand Interactions 序添加 Na 和 + Cl ，浓度为 0.15 nmol/L。在 MD 前
–
程序下的 CDOCKER 模块进行分子对接。Input 还需能量最小化，促使后续 MD 更快达到平衡。