Page 107 - 《中国药科大学学报》2026年第1期

第 57 卷第 1 期 钱程昱，等：黄芪桂枝五物汤通过 Nrf2/HO-1 通路改善脑缺血损伤的机制研究 101

0.05% 胰蛋白酶，37 ℃ 水浴消化 10 min；加入含胰 2.9 CCK-8 法检测细胞活力
蛋白酶抑制剂和 2% B27 的神经基础无血清培养 取 96 孔板培养的原代神经元细胞，按照“2.8”
基终止消化；离心收集细胞，加入培养液重悬细胞 项方法进行 OGD/R 模型建立及给药。药物处理完
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制备细胞悬液，以 4×10 个/mL 的细胞密度种植到 毕，弃去培养基，每孔加入培养基（含 10% CCK-8）
共聚焦皿和铺有玻璃盖片的 35 mm 皿中，培养 100 μL，放入培养箱孵育 30 min。酶标仪检测 450
30 min 后，添加生长培养基至终体积，每隔 3 天更 nm 处吸收度，每组 5 个复孔，取平均值，计算各组
换一半培养基。 细胞存活率：细胞存活率（%）=[（实验孔吸收度−空
取出培养 7 d 的皮层神经元细胞，4 ℃ 下 4% 白孔吸收度）/（对照孔吸收度−空白孔吸收度）]×100。
多聚甲醛固定 30 min；5% 胎牛血清室温封闭 1 h， 2.10 LDH 漏出率
加入山羊抗兔 MAP-2 一抗（1∶250），4 ℃ 过夜；PBS 取 24 孔板培养的原代神经元细胞，按照“2.8”
清洗 3 次；加入 CY3 标记的山羊抗兔 IgG（1∶1 000） 项方法进行 OGD/R 模型建立及给药。待培养结
避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次；加入荧光染料 DAPI 束，收集上清液检测 LDH 活力。
复染细胞核，避光孵育 20 min，PBS 清洗 2 次；用防 2.11 RNA 分离提取及 qRT-PCR
荧光淬灭封片剂封片，显微镜下观察原代培养神经 目的基因以及内参基因的 PCR 引物序列均参
元的染色情况。 考自 Origene，由 Invitrogen 生物技术有限公司合
2.8 细胞 OGD/R 模型建立及给药 成、纯化，并经质量检测。Trizol 一步法提取组织或
取 6 孔板培养的原代神经元细胞，除对照组更 细胞总 RNA，按照逆转录试剂盒说明书，37 ℃ 孵
换含 10% FBS 的完全培养基，其余各组均更换为无 育 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃，2 min，获得的 cDNA 样品
糖培养基，放置于缺氧小室内，向小室内持续充入 –80 ℃ 保存。取 96 孔 PCR 板，依次加入下列成分
94% N +5% CO +1% O 的混合气体 5 min 后，关闭 （总体积 20 μL）： EvaGreen supermix 10 μL，混合引
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2
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缺氧小室进行氧糖剥夺处理，缺氧孵育 4 h 之后更 物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 1 μL，超纯水 8 μL。涡
换含有药物和 10% FBS 的完全培养基，正常氧浓度 旋混匀，1 500 r/min，离心 2 min，按下列循环条件反
继续培养 20 h，药物终浓度（按生药量计）为 0、8、 应：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，10 s，40 个循环；65 ~
16、32 mg/mL。另设正常培养的细胞作为对照组。 95 ℃，10 min。引物设计见表 1。

Table 1 Mouse primer sequences for qRT- PCR
Gene Forward primer（5′→3′） Reverse primer（5′→3′）
Nrf2 TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC
HO-1 AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA
Bcl-2 ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC GGTATGCACCCAGAGTGATGC
Bax TGAAGACAGGGGCCTTTTTG AATTCGCCGGAGACACTCG
GAPDH ATATGGTACGCGAGGTGAGG GTGATTTTAGGGACGCTCCA

2.12 Western blot 检测 3 结 果
提取脑组织蛋白，采用 BCA 蛋白浓度测定试
3.1 HGWD 可减轻 MCAO 小鼠脑缺血损伤
剂盒测定蛋白含量。蛋白变性后，进行聚丙烯凝胶
神 经 行 为 学 评 分 结 果 显 示 ， HGWD-H 和
电泳，蛋白上样量为 60 μg，按相对分子质量大小不
同，制备不同浓度凝胶，电泳条件为 80 V，30 min； HGWD-L 治疗组均可明显减轻模型小鼠的行为学
120 V，80 min。湿转条件为 0.32 A，3 h。凝胶成像 症状，改善程度与阳性药 NBP 相当 (图 1-A)。模型
仪曝光 30 min。 组小鼠则出现明显的缺血灶，组内脑梗死率均值为
2.13 数据处理与统计学分析 12.6%；HGWD-H、HGWD-L 和 NBP 治疗组脑梗死
数据均以 x± s表示，用 GraphPad Prism 6 作图， 率均值分别为 6.8%、7.5% 和 6.7% (图 1-B、图 1-I)。
组间比较采用 One-Way ANOVA 分析方法，P<0.05 模型组小鼠脑组织含水量显著增加，出现明显的水
认为有统计学意义。 肿；HGWD-H、HGWD-L 和 NBP 各治疗组均可以