Page 42 - 《中国药科大学学报》2025年第5期
P. 42
574 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 572 − 582 第 56 卷
的识别。此外，通过加入 AMPK 抑制剂 Compound C 1.3 细胞株
观察到 MET 可诱导独立于 AMPK 激活的 AKR1C3 HCC 细 胞 系 HCC-LM3、 Hep3B、 HepG2、
降解。上述发现不仅阐明了 MET 调控 AKR1C3 蛋 SMMC-7721、 MHCC-97H、 MHCC-97L、 Bel-7402、
白稳定性的分子机制，更从药物-靶点互作层面为 SK-Hep-1 和 HEK-293T 细胞株购自中国科学院细
MET 应用于 HCC 精准治疗提供了新的分子机制 胞库。
框架。
2 方 法
1 材 料
2.1 细胞培养
1.1 药品及试剂 用含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素和链霉素
二甲双胍（上海阿拉丁生化科技股份有限公 的 DMEM 高 糖 培 养 基 培 养 HCC-LM3、 Hep3B、
司 ） ； DMEM 高 糖 培 养 基 、 RPMI 1640 培 养 基 、 MHCC-97H、 MHCC-97L、 HepG2、 SK-Hep-1 和
DMEM/F12 培养基、胎牛血清（美国 Gibco 公司）； 293T 细胞，用含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素和
青霉素-链霉素双抗；AKR1C3 抗体（武汉爱博泰克 链霉素的 RPMI 1640 培养基培养 SMMC-7721 和
生物科技有限公司）；p62、LC3、β-actin、HA-Tag Bel-7402 细胞，所有细胞均置于 5% CO ，37 ℃ 恒
2
抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；AMPK、P- 温的培养箱中。
AMPK 抗 体 （ 沈 阳 万 类 生 物 有 限 公 司 ） ； Alexa 2.2 稳转株构建
Fluor 488 偶联二抗、Alexa Fluor 594 偶联二抗（英 将 293T 细胞接种于 6 孔板中，根据上海翌圣
®
®
国 Abcam 公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）、DAPI、 生物科技有限公司慢病毒包装试剂盒操作，收集好
MTT（江苏凯基生物技术股份有限公司）；BCA 定量 的病毒上清液经 0.45 μm 滤头过滤后，液氮瞬冻后
试剂盒、蛋白分子量标准、IP 裂解液、RIPA 裂解 置于−80 ℃ 保存备用。将病毒上清液与完全培养
液、硝酸甲基纤维素膜（美国 ThermoFisher 公司）； 基按一定比例混合，并按 1∶1 000 的比例加入聚凝
脱脂牛奶（美国 Bio-Rad 公司）；化学发光液（上海天 胺。将混合好的病毒液体加至目的细胞进行侵染，
能生命科学有限公司）；蛋白酶抑制剂、放线菌酮 侵染 48 h 后，用相应真核抗生素筛选细胞，连续筛
（ cycloheximide， CHX） 、 逆 转 录 试 剂 盒 、 Hieff ® 选 3 代后利用 Western blot 或 RT-qPCR 检测侵染
qPCR SYBR Green Master Mix （low Rox）、慢病毒 效率。
包装试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司）；Trizol 2.3 MTT 实验
RNA 提取试剂、高效 cDNA 一链合成试剂盒、高特 收集对数生长期的目的细胞，按每孔 5 000 个
异性染料法定量 PCR 检测试剂盒（南京诺维赞生物 细胞密度接种到 96 孔板，每孔加细胞悬液 200 μL。
科技有限公司）；聚凝胺（美国 Millipore 公司）； 细胞贴壁后，开始加药，继续培养一段时间后，每孔
MG132（美国 Selleck 公司）； shAKR1C3 慢病毒质 加入 MTT 溶液 20 μL，培养 4 h 后，弃上清液，每孔
粒、shSQSTM1 慢病毒质粒、真核表达载体同义突 加 DMSO 100 μL，轻微振荡，用针尖吸掉孔内气泡
变过表达 AKR1C3 质粒（pcDNA3.1-AKR1C3）（上 后，酶标仪检测 570 nm 和 630 nm 波长下的吸收度。
海吉玛基因公司）；Protein A/G 琼脂糖珠（美国 2.4 集落形成实验
Santa Cruz Biotechnology 公 司 ） ； BCECF-AM、 收集对数生长期的目的细胞，按每孔 1 000 个
BeyoClick™ EdU-488 细胞增殖检测试剂盒（碧云天 细胞密度接种到 12 孔板，每孔加细胞悬液 2 mL，
生物技术有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。 轻拍混匀，等细胞贴壁后开始加药，12~14 d 左右取
1.2 仪 器 出。弃培养基，4% 多聚甲醛固定 15 min，0.1% 结
NanoDrop™ One/OneC 微量 UV-Vis 分光光度 晶紫溶液染色 15 min，冲洗晾干后拍摄，用 ImageJ
计、PCR 扩增仪、实时荧光定量 PCR 系统（美国 计算集落数量。
Thermo 公司）；STELLARIS 激光共聚焦显微镜、 2.5 EdU 增殖实验
DMi8 倒置荧光显微镜（德国 Leica 公司）；电泳仪、 根据 BeyoClick™ EdU-488 细胞增殖检测试剂
全湿转膜槽（美国 Bio-Rad 公司）；全自动化学发光 盒说明书操作并通过荧光显微镜分析不同组细胞
成像仪（上海天能科技有限公司）。 的荧光细胞比例。
