Page 43 - 《中国药科大学学报》2025年第5期
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第  56 卷第  5 期  齐 磊，等：二甲双胍通过促进醛酮还原酶             AKR1C3 降解抑制肝细胞癌恶性进展的机制研究                    575

                2.6    Transwell 侵袭实验                           12 000 r/min 离心  20 min。收集上清，加入相应抗
                    基质胶提前置于        4 ℃  解冻，将基质胶与无血              体  1 μg，4 ℃  轮转仪轮转过夜。再各加 ProteinA/G
               清培养基按      1∶8 的体积比冰上混合，取混合液              100    PLUS-Agarose 30 μL， 4 ℃  轮转  2 h 后取出，离心机
               μL  加入到   transwell 小室的上室，37 ℃    静置   30 min。   2 500 r/min，4 ℃  离心  5 min，弃上清液。用提前预
               下室加入含有        2 万个细胞的无血清的培养基              100    冷的   PBS  洗  3 次，加  IP  裂解液重悬，与上样缓冲液
               μL。下室加入含有          10%~20% FBS   的培养基     800    混合，100 ℃    加热  10 min，最后按照“2.8”项方法进
               μL。37 ℃   培养   48 h 后，除去上室中基质胶和未穿                行蛋白质免疫印迹实验。
               过滤膜的细胞。4%         多聚甲醛固定        15 min，0.1%  结    2.11    免疫荧光染色
               晶紫溶液染色        10 min。冲洗晾干后在显微镜下观                      收集对数生长期的目的细胞，并接种到共聚焦
               察细胞数量并拍照，用          ImageJ 计算细胞数量。               小皿中，待细胞贴壁且单层细胞融合度达                      70%~
                2.7    划痕修复实验                                   80%，加药处理一段时间后。用              4%  多聚甲醛固定
                    收集对数生长期的目的细胞，并接种到                  6 孔板     15 min，0.3% Triton 透化  10 min，山羊血清封闭      1 h，
               中，待细胞贴壁且单层细胞融合度达                    90%~100%     一抗   4 ℃  摇床孵育过夜。对应的荧光二抗                37 ℃
               后，用   20 μL  枪头在细胞表面划两条直线。弃培养                    摇床孵育     1 h。DAPI 37 ℃   摇床孵育     20 min，PBS
               基，并用    PBS  轻轻洗涤，显微镜下随机选择              5 个视     洗去多余     DAPI。用超高分辨共聚焦显微镜拍摄，
               野拍摄划痕，记为         0 h。并在    6 孔板中加入含        1%    用  Leica 软件处理图像。
               FBS  的培养基，37 ℃     培养   48 h，显微镜选择相同拍             2.12    细胞热转移
               摄 点 再 次 拍 摄 划 痕 ， 观 察 细 胞 划 痕 的 距 离 ， 用               收集药物预先处理后的细胞和等量的对照细
               ImageJ 计算伤口愈合百分比（迁移率）。                           胞，用含蛋白酶抑制剂的冰预冷                PBS  重悬细胞沉
                2.8    蛋白质免疫印迹实验                                淀。分装至      10 个  PCR  管，药物组和对照组各         10 个
                    蛋白质免疫印迹用于           AKR1C3、p62、LC3 等        温度   (37~67 ℃)，共  20 管。将    PCR  管置于对应温
               蛋白的检测，使用        β-actin 作为内参。收集生长对数              度加热    3 min，立即取出室温放置          3 min，液氮冷冻
               期的目的细胞，根据细胞密度加入相应体积的                             样品，上述操作重复两次。接着细胞在液氮中反复
               RIPA  裂解液，超声破碎        10 s 后, 12 000 r/min，4 ℃   冻 融  2 次 ， 振 荡 混 匀 ， 细 胞 裂 解 物    4  ℃ 、 12 000
               离心   20 min。收集上清液进行          BCA  蛋白浓度定          r/min 离心  20 min，取上清液加入上样缓冲液混匀，
               量，与上样缓冲液混合，涡旋混匀后                100 ℃  加热  10    100 ℃  加热  10 min 变性，按照蛋白质免疫印迹中描
               min 变性，冰上冷却保存备用。根据所需的蛋白相                         述的方法电泳和转膜。
               对分子质量制备相应浓度的              SDS-聚丙烯酰胺凝胶，            2.13    数据统计与分析
               电泳条件为      80 V  恒压，30 min；120 V  恒压，1 h。转            统 计 数 据 表 示 为    x± s， 组 别 显 著 性 差 异 用
               膜条件为     250 mA 恒流   120 min。5%  的脱脂牛奶室          student t-test 检验（双侧）分析。柱形和折线统计图
               温封闭    1 h，一抗  4℃  孵育过夜，二抗常温孵育            1 h。   都通过    GraphPad Prism  软件绘制。
               配制新鲜     ECL  发光液滴加到      NC  膜上，在全自动化
                                                                 3    结 果
               学发光成像仪显像，图像结果用              ImageJ 分析。
                2.9    RNA  分离提取和   RT-qPCR                      3.1    肝癌细胞对二甲双胍的敏感性与             AKR1C3 表
                    收集细胞，根据细胞密度加入相应体积的                          达水平相关
               Trizol 试 剂 提 取 总   RNA。 使 用    NaanoDrop 测 定          为 探 讨 肝 癌 中    AKR1C3 表 达 与    MET  敏 感

               RNA  浓度，使用一步法         cDNA  合成试剂盒逆转录             性 的 相 关 性 ， 测 定 了     8 株 肝 癌 细 胞 系 的 基 础
               得到   cDNA。使用高特异性染料法定量                PCR  检测     AKR1C3 蛋白表达水平及对应             MET  药物的    IC 。
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               试剂盒进行实时荧光定量              PCR  检测。使用（2     -ΔΔCt ）  如图  1 所示，AKR1C3 高表达细胞系表现出更低的
               方法计算相对       mRNA  表达水平，并以       β-actin mRNA    MET  半数抑制浓度，提示          AKR1C3 高表达的肝癌
               水平进行标准化。                                         细 胞 对   MET  具 有 更 强 的 药 物 敏 感 性 ， 且 通 过
                2.10    免疫共沉淀                                   Spearman 相关性分析进一步证实，AKR1C3 蛋白表
                    收集细胞，加      IP  裂解液，冰上静置      15 min，4 ℃    达水平与     MET  的  IC 之间存在统计学显著的强负
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