Page 44 - 《中国药科大学学报》2025年第5期
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576                      学报   Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 572 − 582  第 56 卷
                  A                              B   150                 HepG2     C  100          P=0.001 2

                                                                         HCC-LM3
                              MHCC-97H
                                                                                                   r =0.846 2
                                                                                                   2
                         Hep3B SMMC-7721 Bel-7402 HCC-LM3 HepG2 SK-Hep-1 MHCC-97L  100  Bel-7402  80
                                                                         SMMC-7721
                                                                                      60
                                                                         Hep3B
                  AKR1C3                            Relative cell viability/%  50  SK-Hep-1  IC 50 /(mmol/L)  40
                    β-actin                                              MHCC-97H     20
                                                                         MHCC-97L
                                                      0
                                                       0     20    40    60            0 0  1    2    3   4
                                                          c(metformin)/(mmol/L)             AKR1C3/β-actin
               Figure 1    AKR1C3 expression correlates with metformin (MET) sensitivity in hepatocellular carcinoma (HCC) cells
               A: AKR1C3 protein content in eight HCC cell lines by Western blot assays; B: IC 50  of MET for 24 h in different HCC cell lines by CCK-8
               assay; C: Correlation analysis of AKR1C3 and IC 50  of MET. Spearman correlation analysis using Prism GraphPad software （n=3）
               相关（P=0.001 2，r =0.846 2）。                         3.3    二甲双胍促进肝癌细胞中         AKR1C3 的降解
                              2
                3.2    MET  对肝癌细胞恶性进展的抑制部分依赖于                        接着，进一步分析了         MET  对  AKR1C3 表达的
               AKR1C3                                           影响，通过时间-浓度梯度实验系统评估了                   MET  的
                    为了明确     MET  对肝癌细胞增殖的抑制作用是                 调控效应。如图        3-A  所示，在   HCC-LM3 和   HepG2
               否依赖于     AKR1C3。首先构建敲低        AKR1C3(shA1C3)     细胞系中，MET       处理可显著降低        AKR1C3 蛋白水
               的  HepG2 细 胞 和 过 表 达      AKR1C3(OEA1C3) 的       平，且呈现明确的剂量依赖性和时间依赖性，而
               Bel-7402 细胞（图    2-A），分别用    4 mmol/L MET  处     qPCR  结果显示     MET  并不影响    AKR1C3 的   mRNA
               理细胞     48 h 进行  EdU  增殖检测，以及持续处理                水平（图    3-B）。上述结果提示         MET  在转录后水平
               1~2 周进行集落形成能力检测。EdU               和集落形成          调控   AKR1C3 的表达。为检测         AKR1C3 蛋白稳定
               实验结果如图        2-B，2-C  所示，在对照     HepG2 细胞       性变化，采用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX，15
               中，MET   显著抑制细胞增殖活性，表现为集落形成                       μg/mL）追踪实验。结果如图             3-C  所示，在   HCC-
               数减少了     61%，EdU   阳性比例减少       48%；而在敲低         LM3 和  HepG2 细胞中，相比对照组，MET             处理后
               AKR1C3 组中，MET      的抑制作用显著减弱，集落形                 AKR1C3 降解速度加快，半衰期缩短。以上结果证
               成数仅减少了        12%；EdU  阳性比例仅减少约          28%。    明  MET  可以促进    AKR1C3 降解。
               相反地，在      Bel-7402 细胞中过表达        AKR1C3 后，           为了探究     MET  是否与   AKR1C3 存在结合，采
               MET  抑制效应显著增强，集落形成抑制率从对照组                        用分子对接技术预测，如图             3-D  所示，结果显示两
               的  15%  增加至   49%，EdU  阳性比例抑制率从对照                者结合自由能       ΔG  为–108.07 kJ/mol，且关键相互作
               组的   25%  增加至   75%。上述结果提示         AKR1C3 可      用分析表明      AKR1C3 的  GLU192、ASP224、SER217
               以介导    MET  对肝癌细胞增殖能力的抑制作用。                      位点与     MET  形成氢键。以上结果提示              MET  与
                    为探究   MET  对肝癌细胞迁移侵袭的抑制作用                   AKR1C3 结合可能性高。基于此预测，通过细胞热
               是否受到      AKR1C3 的影响，用      MET（4 mmol/L）处       转移实验验证细胞水平上            AKR1C3 和   MET  是否存
               理敲低     AKR1C3 的   HepG2 和过表达      AKR1C3 的      在结合，使用       MET（1 mmol/L）处理    HepG2 细胞系
               Bel-7402 细胞  48 h 后，划痕修复实验和          Transwell   以及外源性转入         Flag-AKR1C3 后的   HEK-293T  细
               实验结果如图        2-D，2-E  所示，在对照     HepG2 细胞       胞，检测    8 个不同温度下       (37~64 ℃) AKR1C3 蛋白
               中，MET   显著抑制细胞迁移侵袭能力，侵袭数目减                       的水平。结果如图           3-E  所示，随着温度的升高，
               少了   54%，迁移率减少       46%；而在敲低      AKR1C3 组      AKR1C3 蛋白质逐渐降解，但在加入               MET  处理后
               中，MET   抑制作用较弱，侵袭数目仅减少了                  25%；    熔 解 曲 线 显 著 右 移 ， 即 相 同 温 度 下 ， 未 降 解 的
               迁移率仅减少       29%。相反地，在       Bel-7402 细胞中过       AKR1C3 蛋白水平提高，提示           MET  可以通过结合
               表达   AKR1C3 后，MET    抑制效应显著增强，侵袭抑                AKR1C3 促 进 其 热 稳 定 。 以 上 结 果 共 同 说 明
               制率从对照组的        43%  增加至   69%，迁移抑制率从对            AKR1C3 能够直接与       MET  结合。
               照组的    44%  升至约   75%。上述结果提示          AKR1C3      3.4    二甲双胍促进肝癌细胞中        AKR1C3 的自噬降解
               可以介导     MET  对肝癌细胞的侵袭转移的抑制作用。                        细胞内蛋白质的降解主要包括泛素介导的蛋
                    以上结果共同说明          AKR1C3 可以增敏       MET     白酶体途径和自噬诱导的溶酶体途径。为明确
               对肝癌细胞恶性进展的抑制作用，MET                 的抑制效应         MET  诱 导  AKR1C3 蛋 白 降 解 的 具 体 通 路 机 制 ，
               可能部分依赖于        AKR1C3。                           在经   MET  处理的    HCC-LM3 和   HepG2 细胞中，分
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