Page 31 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

第 56 卷第 5 期 张惟杰，等：基于 CRISPR/Cas9 系统的原位生物成像方法进展 563

示。Hong 等 [52] 提出了双分子荧光互补（bimolecular 用于需要高度精确定位的实验。
fluorescence complementation, BIFC）方法，在 dCas9
4 总结与展望
上标记了 Suntag 标签，并在 sgRNA 茎环上整合了
MS2 适体。与当前常用的 dCas9/gRNA 基因组标 CRISPR/Cas9 系统介导的原位成像（表 1）在生
记方法相比，他们发现，在没有 dCas9 的情况下，标 物成像领域潜力巨大，在活细胞和固定细胞成像中
记的 gRNA 转录本积累可能导致显著的非特异性 优势独特。该系统借助 dCas9 蛋白变体，通过瞬时
标记。而使用 BIFC-dCas9/gRNA 方法，则显著提 转染在活细胞中表达，生物相容性良好，对染色质
高了信噪比，并且避免了非特异性标记，证明了共 结构、基因表达及细胞的正常生理功能不会产生
定位方法在提高特异性方面的优越性。Peng 等 [53] 显著影响 [24，32，39，47] 。在活细胞成像方面，CRISPR/
将人异染色质蛋白 1α（HP1α）与荧光蛋白融合，通
Cas9 技术克服了传统 FISH 技术的局限性，例如
过 dCas9 上偶联的 SunTag 肽标签，将 HP1α 招募至
CRISPRainbow 和 LiveFISH 等系统，能够在不破坏
特定基因组位点，从而实现了基因组成像和表达调
细胞和核酸结构的情况下，实时追踪基因组位点的
控。为了进一步提高信噪比，他们在 sgRNA 中整
动态变化，为研究染色质动力学、基因转录和 DNA
合了 MS2 和 PP7 适体，采用双色标记基因组位点，
修复等生物学过程提供了新的视角。在固定细胞
排除了 dCas9 或 sgRNA 脱靶引起的非特异性信
成像方面，CRISPR/Cas9 与核酸信号扩增反应的结
号，达到了更高精度的标记。
合，例如 CasPLA 方法，极大地提升了信号放大能
力，使得成像不再局限于端粒和着丝粒等高重复序
列，实现了非重复单拷贝基因组位点成像，扩展了

scFv-荧光蛋白 可研究的基因组位点的范围。
尽管 CRISPR/Cas9 原位成像技术具有诸多优
势，但也面临一些挑战。例如，CRISPR/Cas9 系统

可能出现脱靶效应，从而增加假阳性率。此前，A-
U 碱基对翻转和扩展发夹结构策略已在改善信噪
[16]
MS2/PP7 比和减少脱靶效应方面取得一定进展 ，但仍需进
MCP/PCP-荧光蛋白 一步优化设计，以提高特异性和标记效率。此外，
图 5 Cas9 蛋白与工程化 sgRNA 同时偶联荧光标签 质粒和病毒载体的递送效率较低，增加了成像的时
尽管 Cas9 蛋白与工程化 sgRNA 同时偶联荧 间成本。用于成像的有机染料也存在生物毒性、透
光标签的方法增加了质粒转染的复杂性并降低了 膜性差等问题，可供选择的种类有限。并且，现有
标记效率，但它实现了更高的信噪比和绝对特异 的成像信号放大策略主要针对高重复和低重复序
性。从通用性角度来看，此方法并不简便，更适合 列，能实现单拷贝非重复序列成像的方法仍较少。

表 1 CRISPR/Cas9 原位成像方法特点
标签偶联位置 标签类型 主要成像靶标 特 点
dCas9蛋白 荧光蛋白 活细胞 经典方法、无信号放大、多重复杂
肽阵列 活细胞与固定细胞 一定的信号放大、标签尺寸大、多重复杂
分裂蛋白 活细胞 灵敏度和特异性提高、通用性降低、多重复杂
sgRNA 配体 活细胞 一定的信号放大、多重简便
寡核苷酸探针 活细胞与固定细胞 极大的信号放大、需要的标记位点少、标记效率低、多重简便
RNA结合蛋白 活细胞 一定的信号放大、需额外转染质粒、多重简便
dCas9蛋白与sgRNA 荧光蛋白、配体等 活细胞 高灵敏度与特异性、需转染更多额外质粒

目前，基于 CRISPR/Cas9 的成像系统仍处于科 临床实践。活体成像面临的主要挑战包括：（1）血
研探索阶段，尽管在基础研究中已展现出潜力，但 浆中的各种核酸酶和蛋白酶导致的降解问题，这需
[54]
由于主要受限于体外细胞模型，尚未大规模应用于 要构建稳健的递送载体 ;（2）细菌来源的 Cas9 蛋