Page 27 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

第 56 卷第 5 期 张惟杰，等：基于 CRISPR/Cas9 系统的原位生物成像方法进展 559

这些方法可以有效成像端粒和高重复序列，但 1.2 Cas9 融合功能标签蛋白
无法成像低重复序列，且缺乏信号放大手段。近年 Cas9 融合功能标签蛋白的方法是在 Cas9 融
来，Chen 等 [19] 开发了一种新型 DNA 标签，称为 合荧光蛋白的方法上进行了信号放大或特异性的
“CRISPR-Tag”，用于标记活细胞中的内源性蛋白 改良，以功能标签蛋白作为中转募集更多或更强的
质编码基因。该方法将秀丽隐杆线虫基因组中的 荧光信号分子。
2~6 个 CRISPR 靶向 DNA 序列整合到特定的人类 1.2.1 Cas9 融合肽标签 为了募集更多的荧光蛋
基因中，随后通过 dCas9 融合荧光蛋白进行成像。 白达到信号放大的效果，Vale 等 [24] 开发了一种名
这种标签不会影响基因表达，且可以进行长期追 为 SunTag 的重复肽阵列蛋白质支架。在该方法
踪。通过在靶标基因附近引入额外的 DNA 标签， 中，多个抗原表位短肽 GCN4 功能标签被融合
增加了 CRISPR/dCas9 结合位点，从而实现了信号 到 dCas9 上，通过单链可变片段抗体（single-chain
放大，使得 dCas9 融合荧光蛋白能够成像基因组中 variable fragment, scFv）与 GCN4 之间的相互作用，
的非重复序列。然而，该方法涉及基因编辑，需预 在肽阵列上招募了 24 份 GFP-scFv 融合蛋白，实现
先将标签敲入靶点，因此具有较高的成本和局限 了对 5 号染色体上 21 拷贝低重复序列的成像，如
性，且不具通用性。 图 1-B 所示。随后，Ye 等 [25] 将 GFP-scFv 融合蛋白
在实际应用中，Fan 等 [20] 设计了一种 DNA 框 改良为单体黄绿色荧光蛋白（monomeric yellow-
架状态机器，使用 EGFP 与 dCas9 融合蛋白，在时 green fluorescent protein, mNeonGreen）与 scFv 融合
间可控的方式下靶向活细胞中的染色质端粒等位 蛋白，显著增强了单分子荧光的强度。
点。这一研究为复杂生物环境中的生物计算和智 Knight 等 [26] 不再将目光局限于荧光蛋白，开发
能治疗提供了启示。另有 Ohmido 等 [21] 利用 GFP 了一种 dCas9 与 HaloTag 功能标签蛋白的融合蛋
与 dCas9 融合蛋白，实时成像人类细胞系衰老过程 白。HaloTag 是一种改良型卤烷脱卤酶，能够与合
中着丝粒区域的染色质动力学，发现染色质结构波 成配体有机荧光染料共价结合，提供比荧光蛋白更
动的增加促进了衰老过程中着丝粒的混乱。 强的荧光信号，实现了信号放大，如图 1-C 所示。
在固定细胞成像方面，Takei 等 [22] 和 Guan [23] 在 固 定 细 胞 成 像 方 面 ， Deng 等 [27] 提 出 的
等将 CRISPR/Cas9 原位成像与 DNA FISH 技术相 CASFISH 方法同样使用 dCas9-HaloTag 融合蛋白
结合。他们首先使用 dCas9-EGFP 融合蛋白标记和 进行成像。尽管该方法失去了活细胞成像中追踪
跟踪活细胞中的染色体位点，然后在细胞固定后， 靶标的时间动态能力，但与活细胞成像相比，它无
通过 DNA FISH 对这些位点进行标记并解析其身 需转染和递送，操作更快速、经济且便捷。此外，
份。这种方法仅使用一种细菌来源的 dCas9 蛋白 CASFISH 方法相比传统的 DNA FISH，不仅节省了
即可完成多靶标位点的成像，简化了传统的多色成 时间，还能更好地保存细胞形态和 DNA 结构。
像方法，避免了使用不同细菌 dCas9 融合荧光蛋白 在近期研究中，Neguembor 等 [28] 将 CRISPR-
的复杂性，从而节省了时间和成本。 SunTag 系统与多顺反子载体相结合，开发出 (Po)
Cas9 融合荧光蛋白是 CRISPR/Cas9 系统经典 STAC（polycisstronic SunTAg modified CRISPR）方
成像技术，可成像端粒等高重复序列，但存在不 法。此方法提升了多个基因组位点的标记效率，增
足。首先，Cas9 融合荧光蛋白会大量结合基因组 强了信号，能够对活细胞中的基因组动态进行更长
CRISPR 靶标，干扰基因组位点动态过程；其次，低 期、更快速的成像。Hou 等 [29] 则把 CRISPR-SunTag
重复序列因缺乏结合位点，无法有效成像，亟需通 系统和光诱导核输出标签（light-inducible nuclear
用高效的信号放大手段；并且多色成像依赖转染多 export tag, LEXY）相结合。利用 SunTag 系统，将多
种非同源细菌 Cas9 蛋白，需进行正交筛选与多蛋 个拷贝的、由 LEXY 标记的超折叠绿色荧光蛋白
白共转染，过程繁琐耗时；此外，Cas9 蛋白与核仁 （super folding green fluorescent protein, sfGFP）募集
区域有天然非特异性结合，端粒成像时，EGFP 与 到 C 端 dCas9。在识别基因组位点后，脉冲蓝光照
dCas9 融合蛋白常出现核仁样信号，端粒信号不易 射会暴露 C 端 LEXY 的核输出序列，未结合的非靶
被观察到。 向核标记模块便被光控转移到细胞质，显著提高了