Page 30 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

562 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 557 − 565 第 56 卷

白相比，配体有机染料具有更强的荧光强度、更好 提高了检测效率。通过在间隔区前加入 5~6 碱基
的光稳定性和更低的背景信号。然而，目前能对活 长的环状发夹结构优化 sgRNA 设计，可以显著提
细胞无毒的有机染料种类仍然较少。 高 CRISPR 探针在单碱基突变位点的识别特异
2.2 工程化 sgRNA 杂交寡核苷酸探针 性。除了 RCA 反应，CRISPR/Cas9 还可以与其他
sgRNA 的茎环除了可以整合为适体结构外， 核酸扩增反应结合。Li 等 [50] 将 CRISPR/Cas9 原位
还可以替换为特定序列的发夹结构，与对应的寡核 成像与引物交换反应（PER）核酸扩增方法结合，使
苷酸探针杂交。Mao 等 [48] 将分子信标（molecular 用 sgRNA 茎环区杂交 PER 延伸探针及多轮分支探
beacon, MB）用于杂交 sgRNA 的茎环区域，实现了 针，同样实现了对基因组单拷贝非重复序列的成
像，如图 3-C 所示。与 RCA 反应相比，PER 避免了
对 MUC4 基因低重复区域的成像，如图 3-A 所示。
多步酶促反应原位控制的复杂性，显著减少了时间
MB 作为有机染料修饰，具有比荧光蛋白更强的荧
成本，且探针设计简洁、具有较高的可编程性。
光强度和更低的背景信号。
通过在固定细胞中将工程化 sgRNA 茎环替换
A

MB 为特定的发夹序列，并与核酸扩增反应结合，可以
大大放大基因组位点的信号，甚至实现单拷贝非重
复序列的成像，这在活细胞中难以实现。此外，这
类方法在固定细胞中的通用性较强，只需要探针和
B
荧光探针 酶即可进行各种扩增反应，而不需要转染质粒或递
RCA扩增 送染料，降低了时间和经济成本。
产物
2.3 工程化 sgRNA 结合 RNA 结合蛋白
除了四环和茎环 2 区，工程化 sgRNA 的 3'末

C 端序列也可以替换为其他序列，但这种替换通常会
导致 sgRNA 识别靶标的效率显著下降 ，因此应用
[39]
PER扩增 较少，研究价值有限。Clow 等 [51] 在 sgRNA 的 3'末
产物 迭代PER
探针
端插入了一个被 Pumilio/FBF（PUF）RNA 结合结构
域识别的序列，并通过 PUF-荧光蛋白融合蛋白实现
图 3 工程化 sgRNA 杂交寡核苷酸探针
A: sgRNA 杂交分子信标（MB）；B: sgRNA 结合滚环扩增（RCA）反 了对活细胞基因组位点的成像。在此方法中，3'末
应；C: sgRNA 结合引物交换反应（PER） 端可以插入最多 15 个 识别序列，从而结合多
PUF
然而，活细胞内缺乏有效的信号放大手段，因 个 PUF-荧光蛋白融合蛋白。通过更换不同的序列
为大多数核酸信号扩增反应需要酶的参与。在固 和荧光蛋白种类，可以实现多色成像。该方法成功
定细胞内，sgRNA 茎环与寡核苷酸探针杂交的方法 应用于 MUC4 基因的高重复和低重复序列的成像，
可以结合各种核酸扩增反应，从而大大增强成像的 如图 4 所示。
可行性。Zhang 等 [12] 首次将 CRISPR/Cas9 原位成
像 与 滚 环 扩 增 （ rolling circle amplification, RCA）
反应结合，提出了 CasPLA 方法。他们使用两个邻
位 sgRNA 的茎环区域杂交滚环探针进行 RCA，并
PUF-荧光蛋白
在 RCA 延伸产物上杂交荧光探针以实现信号放
大。该方法不仅能够成像 mtDNA 单碱基突变，还
能实现 KRAS 基因单拷贝非重复位点的成像，这是 15拷贝
传 统 活 细 胞 CRISPR/Cas9 成 像 难 以 实 现 的 。 图 4 工程化 sgRNA 结合 RNA 结合蛋白

Liang 等 [49] 对 CasPLA 方法进行了优化，将邻位连
3 Cas9 蛋白与工程化 sgRNA 同时偶联荧光标签
接方法改进为两种 sgRNA 共定位的方式，如图 3-
B 所示。这种方法扩展了设计的 sgRNA 之间的距 在 Cas9 蛋白和 sgRNA 上均可以偶联荧光标
离（可达 200 nt），增加了适用靶基因位点的范围，并 签，也可以同时在它们上标记荧光标签，如图 5 所