Page 28 - 《中国药科大学学报》2025年第5期
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560 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 557 − 565 第 56 卷
信噪比，甚至能观察到低至 9 个重复拷贝的基因组 而对任意基因组位点不具备通用性。此外，与所有
位点。Song 等 [30] 重新设计了 dCas9-SunTag 系统的 Cas9 融合功能标签蛋白的方法一样，该方法在多重
核定位序列（nuclear localization sequence, NLS），限 成像方面依赖于多种非同源细菌的不同 Cas9 蛋白
制了进入细胞核的荧光模块数量，使信噪比提高了 转染。
1.6 倍。这些方法均提高了 CRISPR-SunTag 系统的
2 工程化 sgRNA 偶联荧光标签
特异性和信噪比。
除 荧 光 蛋 白 和 有 机 荧 光 染 料 外 ， CRISPR/ 在 CRISPR/Cas9 体系中，除在 Cas9 蛋白上偶
Cas9 还能通过肽标签偶联荧光量子点（quantum 联荧光标签外，还能将其连接至 sgRNA。Silvana
dots, QDs）来成像。量子点是一类直径为 2~10 nm 等 [35] 提出了工程化 sgRNA 的概念，他们发现，sgRNA
的胶体半导体纳米颗粒，具有强荧光强度和长荧光 的四环（tetraloop）和茎环 2（stem loop 2）结构突出
[31]
寿命 ，性能优于荧光蛋白和有机荧光染料，且与蛋 于 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物之外，这些区域
白质结合能力良好。这些特性使其成为生物成像 的序列替换或缺失不会影响 Cas9 的催化功能，因
的绝佳标签，被广泛应用于活细胞成像。目前， 此可用 RNA 适体（aptamer）序列替换，以招募特定
CRISPR/Cas9 偶联量子点的方法主要有两类。一 配体。
类是 Ma 等 [32] 提出的，将硫辛酸连接酶受体多 与 Cas9 蛋白偶联荧光标签相比，sgRNA 偶联
肽（lipoic acid-responsive polypeptide, LAP）融合的 荧光标签成像有天然优势 。工程化 sgRNA 实现
[36]
dCas9，在硫辛酸连接酶作用下与量子点偶联，并对 多重成像只需更改间隔子（spacer）序列和适体茎环
潜 伏 感 染 细 胞 中 的 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 （ HIV） 序列，既节省时间又降低成本。而 Cas9 蛋白偶联
DNA 进行成像。另一类是 Yang 等 [33] 将生物素受 荧光标签进行多重成像，则需要不同细菌种属的
体多肽（biotin-avidin polypeptide, BAP）与 dCas9 融 Cas9 蛋白及其特定的 sgRNA 支架，限制了应用的
合，再与链霉亲和素量子点偶联，对狂犬病毒（PRV） 灵活性。因此，在后续的 CRISPR/Cas9 原位成像研
在细胞中的吸附、沿微管的细胞质运输和核进入动 究中，工程化 sgRNA 成为关注的重点。
态过程进行了监测。这两种方法如图 1-D 所示。 2.1 工程化 sgRNA 适体
此类方法极大增强了单个 CRISPR/Cas9成像分子 适体，也称为化学抗体，是一种功能性寡核苷
的荧光强度与稳定性，可用于更长期的动态监测。 酸，能够通过折叠形成独特的二级或三级结构，进
Cas9 融合肽标签蛋白可放大信号，实现低重 而以高特异性和高结合亲和力与配体结合 。将适
[37]
复序列成像，但存在一些缺陷。SunTag 标签尺寸 体结构整合到 sgRNA 的茎环中 ，可以将相应的配
[38]
大，干扰基因组位点定位与动力学研究。荧光量子 体荧光标签偶联到 sgRNA 上，从而实现 CRISPR/
点方法需多步修饰偶联，标记效率低于常规 CRISPR/ Cas9 对 基 因 组 位 点 的 原 位 荧 光 标 记 。 早 期 研
Cas9 系统，且量子点易形成发光聚集体，导致荧光 究 [39] 通 过 将 MS2 或 PP7 适 体 发 夹 序 列 整 合 进
淬灭。此外，这些方法在多重检测时，需转染多种 sgRNA 的茎环，并与相应的 MS2 外壳蛋白（MS2
非同源细菌的 Cas9 蛋白，多位点成像难度大。 coat protein, MCP） 或 PP7 外 壳 蛋 白 （ PP7 coat
1.2.2 Cas9 融合分裂的功能标签蛋白 为了提高 protein, PCP）配体融合荧光蛋白结合，实现了对基
成像的特异性，Heath 等 [34] 将两个分裂的萤光素酶 因组位点的双重及多重成像，如图 2-A 所示。
片段，分别融合到一对 dCas9 蛋白的 N 端。当这 近年来，针对工程化 sgRNA 适体方法在信号
对 dCas9 同时锚定在目标 DNA 序列的上游和下游 放大方面的改良取得了显著进展。Lyu 等 [40] 将蛋
片段时，分离的萤光素酶片段会重新组装成完整的 白质相分离聚合与工程化 sgRNA 适体结合，使用
酶，进而催化周围的荧光素产生荧光。此方法在提 含有两个 PP7 RNA 适体的 sgRNA 招募由 PP7 外
高特异性的同时实现了信号放大，为低重复序列提 壳蛋白（PCP）、GFP 和 T4 纤维蛋白三聚体基序折
供了灵敏的读数，具体如图 1-E 所示。然而，此类 叠组成的融合蛋白。在靶标位点，sgRNA 与融合蛋
方 法 需 要 依 据 具 体 基 因 组 位 点 上 下 游 间 一 对 白形成聚合物，从而实现信号放大。这一方法可以
CRISPR/Cas9 的距离，对蛋白连接子进行优化，因 有效成像低重复基因组序列及 PPP1R2 基因的单拷
