Page 26 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

558 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 557 − 565 第 56 卷

原位成像技术能实时监测生物分子的空间分 生物成像，主要可分为 3 类：第一类方法通过将 Cas9
布及动态相互作用，为揭示细胞功能机制和疾病病 蛋白与荧光标签偶联，例如将 Cas9 直接融合荧光
理过程提供关键技术支持 [1−3] 。目前，该技术已衍生 蛋白，或将 Cas9 与肽标签融合后，再结合荧光底
出荧光成像、多光子成像等主要方法。其中，荧光 物；第二类方法则通过工程化的 sgRNA 与荧光标
原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH） 签偶联，包括适体化 sgRNA 与配体荧光标签的结
凭借其在核酸定位上的高精度，成为固定细胞成像 合，或 sgRNA 直接与荧光探针杂交；第三类方法同
的金标准 [4−5] 。不过，FISH 技术依赖由 20~100 种、 时在 Cas9 蛋白和工程化 sgRNA 上标记荧光标签，
长度 20~50 个碱基的探针组成的探针组 ，存在设 例如将 Cas9 与荧光蛋白融合和适体化 sgRNA 与
[6]
计复杂、成本高以及难以应用于活细胞成像等固有
配体染料结合同时进行，从而提高信噪比和特异性。
缺陷 [7−8] 。这些弊端促使科研人员探索新型成像方
1.1 Cas9 融合荧光蛋白
法，而 CRISPR/Cas9 系统因自身独特优势，成为这
Cas9 融合荧光蛋白进行成像是 CRISPR/Cas9
一领域的重要突破口。
系统中最经典的成像方法，如图 1-A 所示。Chen
CRISPR/Cas9 系统源于细菌的获得性免疫机
等 [16] 首次使用融合的强化型绿色荧光蛋白（enhanced
制，其核心组件 Cas9 核酸酶可借助单链向导 RNA
green fluorescent protein, EGFP） 与 dCas9 蛋 白 对
（sgRNA）实现对 DNA 的精准识别与切割 [9−10] 。Jinek
人类活细胞的基因组位点进行成像，有效标记了
团队通过突变 HNH 和 RuvC1 结构域，获得了失活
MUC4 基因超过 100 个重复序列的第二外显子区
[11]
型 dCas9 蛋白 。该蛋白变体虽丧失了切割活性，
域。随后，Me 等 [17] 和 Chen 等 [18] 利用不同种类细
但保留了靶向定位能力，为基因组成像奠定了基
菌的 dCas9 融合荧光蛋白实现了对基因组高度重
础。相较于 Cas9，dCas9 在成像效率上更胜一筹 ，
[12]
复序列不同位点的多色标记。
因而成为当前 CRISPR 成像系统的主要工具。
近年来，CRISPR/Cas9 介导的成像技术发展迅 A B
猛。在方法学上，CRISPR/Cas9 主要通过将 dCas9 EGFP scFv-EGFP
偶联荧光标签，或让工程化 sgRNA 结合荧光探
24 拷贝肽阵列
针来实现成像。在应用层面，活细胞成像系统如
CRISPRainbow [13] 和 LiveFISH [14] 显著提高了成像
信噪比（SNR）和成像重数；固定细胞成像则通过将
dCas9 sgRNA
核酸扩增反应引入 sgRNA ，拓展了 CRISPR/Cas9
[15]
在基因组非重复单拷贝序列成像中的应用。 配体染料
C D
现有综述多聚焦于 CRISPR 介导的活细胞成 HaloTag LAP/BAP QD
像，对固定细胞成像的讨论相对较少。然而，固定
细胞成像在生物医学研究和临床诊断中同样发挥
着重要作用。结合核酸信号扩增策略后，其成像应
用得到了极大拓展。本文系统总结了近年来 CRISPR
介导的原位成像技术，涵盖活细胞和固定细胞成
E
像，阐述了其基本原理、优化策略及技术优势。文
章重点探讨了这些方法在信号放大、特异性及多重
检测方面的应用，并结合当前研究进展和临床实践 分裂萤光素酶
进行深入分析，旨在为 CRISPR/Cas9 介导的原位生
物成像提供更全面的认识，为相关研究提供参考。
图 1 Cas9 蛋白偶联荧光标签
1 Cas9 蛋白偶联荧光标签
A: Cas9 融合荧光蛋白；B:Cas9 融合 SunTag 肽阵列；C:Cas9 融
合 HaloTag 结合配体染料；D: Cas9 融合 LAP/BAP 偶联荧光量子
现有的研究使用 CRISPR/Cas9 技术进行原位 点（QDs）；E: Cas9 融合分裂萤光素酶