Page 29 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

第 56 卷第 5 期 张惟杰，等：基于 CRISPR/Cas9 系统的原位生物成像方法进展 561

A B 等 [44] 也利用 Pepper RNA 适体和 tDeg 标签成功实

Tetraloop 现了对端粒、着丝粒等高重复序列以及 MUC4、IL-
RNA适体
1B 等低重复序列的高灵敏度和高特异性成像。这
类方法不同于以往基于 CRISPR/Cas9 的组成型荧
MS2/PP7 配体染料
MCP/PCP-EGFP Stem 光和高背景荧光技术，表现出低背景和强荧光的特
loop 2
点，从而显著提高了基因组 DNA 成像的灵敏度。
C 蛋白酶体 降解 虽然该方法没有实现信号放大，但其低背景和高信

荧光蛋白 噪比的特性使其能够检测到 20 拷贝低重复基因组
未结合dCas9 位点。 适体与荧光蛋白配体结合外，

除了使用
tDeg RNA
还可以直接将 RNA 荧光适体与有机配体染料结
结合dCas9
合，如图 2-C 所示。随着有机染料技术的进步，许
多有机染料 [45] 已经具备比荧光蛋白更强的荧光强

图 2 工程化单链向导 RNA（sgRNA）适体 度、更长的荧光寿命以及更弱的背景信号。这些配
A: sgRNA 四环和茎环 2 区 MS2/PP7 适体化；B: sgRNA 适体结合 体染料在未与适体结合时呈现弱荧光，结合后则发
配体染料；C: tDeg 标签结合 Pepper 适体化 sgRNA
生变构并显著增强荧光强度，比荧光蛋白融合配体
贝序列。Viushkov 等 [41] 比较了 CRISPR-Sirius [42] 方
具有更优的特异性。Jiang 等 [46] 开发了一种新型荧
法的两个版本。与传统的仅含一个或两个适体茎
光 RNA 适体 Clivia，并与对应的有机染料 NBSI 结
环的工程化 sgRNA 不同，CRISPR-Sirius 方法使用
合，产生强烈荧光。这种 Clivia 荧光 RNA 不仅比
包含 8 个 MS2 或 PP7 茎环的 sgRNA，并与荧光
已有的荧光 RNA 更稳定、更亮，而且具有更大的斯
蛋白融合的 MCP 或 PCP 表达系统共同实现信号
托克斯位移。此外，Clivia 荧光团 NBSI 及其类似
放大。通过比较两种递送方法——瞬时转染与
物具有低背景荧光、良好的膜通透性和低细胞毒
慢病毒转导，以及使用两种 CRISPR-Sirius 版本
性。他们使用整合了 Clivia 适体的 sgRNA 对端粒
（MCP 和 PCP），他们评估了多个基因组位点的可视
和着丝粒位点进行了成像，表现出优异的荧光强度
化效率。结果表明，基因座的可视化效率因位点 和特异性。除针对现有染料开发适体 RNA 外，还
而异，MCP-sfGFP 版本在信号检测方面优于 PCP- 可以研发新的染料化学物。Englert 等 [47] 开发了一
sfGFP，且慢病毒转导在基因座成像中效果更佳。 种新型罗丹明染料 SpyRho（螺环罗丹明），该染料
这两种方法在信号放大上取得了重要进展，能够 单独存在时荧光较弱，与 RhoBAST 荧光 RNA 适体
成像低重复基因组序列甚至单拷贝非重复基因组 结合后，荧光强度显著增强。RhoBAST/SpyRho 复
序列。 合物表现出高荧光强度、光稳定性和快速配体交换
相比于 Cas9 蛋白偶联荧光标签的方法，工程 动力学。研究者将 RhoBAST 整合进 sgRNA，用于
化 sgRNA 适体方法在成像时减少了 Cas9 蛋白在 着丝粒位点的可视化，结果显示其荧光亮度高，信
细胞核内的非特异性吸附，显著提高了特异性。然 噪比也较高。使用荧光 RNA 适体与有机配体染料
而，由于仍然依赖于配体融合荧光蛋白，仍可能受 的方法，不需要额外转染荧光蛋白，具有良好的膜
到细胞内荧光蛋白表达的非特异性影响。Zhang 通透性、低细胞毒性，并且由于仅在适体结合时才
等 [43] 使用了新开发的荧光蛋白技术，将 Tat 肽衍生 发光，未结合的配体可以通过洗涤去除，进而减少
的 Degron 结构域（tDeg）与荧光蛋白融合，使荧光蛋 背景信号。
白高度不稳定并迅速降解，如图 2-B 所示。Pepper 适体 sgRNA 是工程化 sgRNA 中最经典的形
RNA 适体可结合并隐藏 tDeg，从而阻止荧光蛋白 式之一，通过在不同 spacer 序列的 sgRNA 上使用
降解。当将 Pepper RNA 适体整合到 sgRNA 上时， 不同的适体和配体组合，可以轻松实现多重成像。
荧光主要集中在与 Pepper RNA 结合的荧光蛋白 改良后的信号放大方法能够成像低重复基因组序
上，而未结合的荧光蛋白会被降解。同样，Chen 列，甚至单拷贝非重复基因组序列。与融合荧光蛋