Page 66 - 《中国药科大学学报》2025年第4期

462 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(4): 460 − 468 第 56 卷

300 g，雌雄各半，动物购于北京维通利华实验动物 Table 1 Related parameters in MS analysis
技术有限公司，动物许可证号：SCXK(浙)2019-0001； Compd. Precursor Daughter Fragmentor/V Collision
ion（m/z） ion（m/z） energy/V
实验动物接收后进行 1 周的适应性饲养，随后进行
Mecobalamin 672.9 665.4 100 18
药代动力学研究。动物房的温度为 20~26 ºC；湿度 Methotrexate
455.0 307.9 150 22
为 40%~70%；12 h 光照黑暗交替；自由饮水和取 (IS)
Ceftriaxone 555.0 396.0 60 10
食；动物实验开始前禁食 12 h。所有实验均符合中
Cefixime (IS) 453.9 285.0 120 18
国药科大学动物伦理标准，伦理编号：2024-05-022。

后，在 15 000 r/min、4 ℃ 条件下离心 15 min，移取
2 方 法
上清液 然后加入纯水 进行稀释，涡
100 μL 100 μL
2.1 溶液的配制 匀后转移至进样小瓶，交由 LC-MS/MS 分析。

分别精密称取甲钴胺和头孢曲松钠对照品于 2.4.2 头孢曲松钠定量分析前处理方法 移取血
1.5 mL 离心管中，分别用 50% 甲醇水溶液溶解得 浆样品 50 μL 至 1.5 mL 离心管中，加入含内标（1
到质量浓度为 0.6 mg/mL 甲钴胺工作液及 10 mg/mL μg/mL 的头孢克肟）的甲醇溶液 300 μL。将样品涡
头孢曲松钠工作液。因两药见光易分解，须在避光 旋 2 min 后，在 15 000 r/min、4 °C 条件下离心 15 min，
条件下现配现用。 移取上清液 100 μL 然后加入纯水 300 μL 进行稀

2.2 色谱条件 释，涡匀后转移至进样小瓶，交由 LC-MS/MS 分析。

2.2.1 甲钴胺定量分析色谱条件 色谱柱：Acquity 2.5 背景扣除法
UPLC BEH C (2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)；流动相 SD 大鼠内源性甲钴胺的平均质量浓度为
18
A：含 0.1% 甲酸& 2 mmol/L 乙酸铵的水溶液；流动 （0.88±0.40） ng/mL，浓度低且昼夜变异性低。因此
相 B：含 0.1% 甲酸的乙腈溶液；进样体积：10 μL；流 本研究采取背景扣除法排除内源性甲钴胺的干扰，

速：0.4 mL/min；梯度洗脱：0~0.3 min 10%B; 0.3~ 准确定量甲钴胺的血药浓度。
2.0 min 10%~95%B; 2.0~3.0 min 95%B; 3.0~3.1 min 对于甲钴胺定量方法建立与验证：在避光条件
95%~10%B; 3.1~3.5 min 10%B。 下，将给药前 0 min 血浆样本各吸取 20 μL 混匀后

2.2.2 头孢曲松钠定量分析色谱条件 色谱柱: 的血浆即为空白血浆。校正样本与质控样本由空
Acquity UPLC BEH C (2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)； 白血浆制备，并在扣除空白血浆中内源性甲钴胺浓
18
流动相 A：含 1% 甲酸水溶液；流动相 B：含 0.1% 甲 度后用于标准曲线的建立与质量控制。对于甲钴
酸的乙腈溶液；进样体积：10 μL；流速：0.4 mL/min； 胺血浆样本的检测：同一大鼠来源的血浆样本，应
梯度洗脱：0~0.3 min 10%B; 0.3~2.0 min 10%~95%B; 扣除该鼠给药前 3 个不同时间点血浆中内源性甲
2.0~3.0 min 95%B; 3.0~3.1 min 95%~10%B; 3.1~ 钴胺的平均浓度以排除内源性干扰。

3.5 min 10%B。 2.6 方法学考证

2.3 质谱条件 2.6.1 专属性和选择性 取 6 份来源不同的 SD 大
选用 AJS ESI 离子源，源气参数如下：干燥气 鼠空白血浆 50 μL，按照“2.4”项分别加内标及不加
温度 300 ℃；干燥气流速 5 L/min；雾化气压力 45 psi 内标处理后进样分析；取同样 6 份来源不同的
（1 psi=6.895 kPa）；鞘气温度 300 ℃；鞘气流速 11 L/ SD 大鼠空白血浆 45 μL，分别加入标曲定量下限处
min；毛细管电压 3 500 V；喷嘴电压 500 V。在正离 的甲钴胺或头孢曲松钠工作液 5 μL，振荡混匀后得
子、MRM 模式下检测,用于定量的离子对及相关质 到含甲钴胺质量浓度 3 ng/mL，头孢曲松钠质量浓
谱信息见表 1，其中氨甲蝶呤、头孢克肟分别作为 度为 0.5 μg/mL 的加药血浆，同样按照“2.4”项分别
甲钴胺、头孢曲松钠定量分析内标化合物。 加内标及不加内标处理后进样分析。

2.4 血浆样品前处理方法 2.6.2 定量下限 取若干份大鼠空白血浆 45 μL，

2.4.1 甲钴胺定量分析前处理方法 移取血浆样 加入工作液 5 μL，配制甲钴胺质量浓度为 3 ng/mL，
品 50 μL 至 1.5 mL 离心管中，加入含内标（30 ng/mL 头孢曲松钠质量浓度为 0.5 μg/mL 的含药大鼠血
的氨甲蝶呤）的甲醇溶液 300 μL。将样品涡旋 2 min 浆，按“2.4” 项下方法处理后进样分析（n=6）。根据