Page 111 - 《渔业研究》2025年第5期

652 渔 业 研 究 第 47 卷

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29×10 t，位居全国海水养殖鱼类第二位。其养殖 鉴于此，本研究针对大黄鱼锥体虫 18S rDNA
区域主要分布于福建、浙江、山东、广东等沿海省 保守序列设计特异性引物与 TaqMan 探针，建立一
份，其中福建省大黄鱼养殖产量占全国大黄鱼养殖 种高灵敏度、高特异性的 qPCR 检测方法，并系统
总产量的 80% 以上，年产值超过百亿元。该产业 评价其线性范围、检测限、重复性及特异性。进一
对推动沿海地区渔业经济发展、保障渔民增收具有 步应用该方法分析锥体虫在大黄鱼不同组织中的分
[2]
重要意义 。然而，随着养殖规模的扩大、养殖密 布特征，以及对养殖区域内的鱼类或非鱼类样品的
度的提高及养殖环境的恶化，大黄鱼病害问题日益 锥体虫感染情况，旨在为大黄鱼锥体虫病的早期诊
突出。其中寄生虫病因隐蔽性强、传播速度快、防 断、流行规律研究及综合防控策略的制定提供关键
控难度大等特点，已成为制约大黄鱼养殖产业健康 技术支撑，同时也为深入解析锥体虫与宿主相互作
发展的严重威胁 [3-4] 。 用机制提供科学依据。
锥体虫（Trypanosoma spp.）属于动鞭毛纲（Zoo- 1 材料与方法
mastigophorea）锥体虫科（Trypanosomatidae） ，是
一类广泛寄生于脊椎动物血液及组织中的原生动物 1.1 实验材料
寄生虫，其生活史复杂，通常需通过宿主与传播媒 鱼类车轮虫（Trichodina）、刺激隐核虫（Crypto-
介（如水生昆虫、甲壳类等）完成世代交替，通过 caryon irritans） 、副溶血弧菌（Vibrio parahaemoly-
叮咬或接触感染宿主后，主要寄生于宿主血液循环 ticus） 、溶藻弧菌（V. alginolyticus） 、神经坏死
系统，以宿主血液中的营养物质为生，通过破坏红 病毒（Nervous necrosis virus, NNV） 、大黄鱼虹彩
细胞、引发免疫炎症反应，导致宿主贫血、器官损 病 毒 （ Large yellow croaker Iridovirus， LYCIV）
伤甚至死亡 [5-6] 。组织病理学研究表明，锥体虫感 等病原阳性样品均由本实验室保存；锥体虫重组质
染可导致鱼类多器官系统性病变，其中脾脏、肝 粒由实验室构建，将包含锥体虫 18S rDNA 靶基因
脏、肾脏及鳃组织损伤尤为显著 [6-8] 。早期诊断是 片段（长度 300 bp）的 PCR 产物克隆至 pMD18-T
防控锥体虫病的关键，精准、快速的检测技术有助 载体中，构建重组质粒 pMD18-T-18S，转化至大
于及时发现感染个体，为隔离治疗与区域防控提供 肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞 DH5α，使
科学依据。目前，鱼类锥体虫的检测方法主要包括 用核酸浓度测定仪（NanoDrop）精确测定质粒
传统显微镜检和分子生物学方法。显微镜检查通过 DNA 的浓度，计算获得其拷贝数浓度，于−80 ℃
观察血液涂片或组织切片中的虫体形态进行诊断， 保存待用。DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有
虽然操作简便、成本低，但依赖操作者的经验，在感 限公司，2×Taq Probe qPCR Mastermix、引物以及
染早期虫体密度较低时易漏检，灵敏度有限 [9-10] 。 探针由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。
常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， Gentier48E 型荧光定量 PCR 仪购自西安天隆科技
PCR）通过扩增虫体特异性基因片段实现检测，灵 有限公司。
敏度优于显微镜检查，但仍仅限定性分析，无法量 1.2 鱼样以及非鱼类样品收集
化感染强度，且需依赖 PCR 仪、凝胶电泳及成像 本研究于 2024 年 9 月 25 日至 2024 年 10 月
系统，难以满足早期低剂量感染检测及流行病学调 20 日在三都岛（26°63′N、119°70′E）、霞浦（26°60′N、
查需求。荧光定量 PCR（Fluorescence quantitative 119°88′E）及连江（26°27′N、119°79′E）三个养殖
PCR，qPCR）技术配套仪器相对简单，具备定量 海区开展生物样品采集。大黄鱼、鲻鱼（Mugil
精确、灵敏度高、特异性强和自动化程度高等优 cephalus） 、真鲷（Pagrus major）三种鱼类，采
点，已被广泛应用于病原微生物检测及基因表达分 用 30 目抄网在各海区分别采集 15~20 尾，采样后
析等领域 [11-12] 。其中，TaqMan 探针法通过特异性 置于原海水暂养，测量体长、体质量并记录个体外
探针与靶序列结合，进一步提高了检测的特异性， 观形态特征（如体色异常、损伤等）与游动状态；
有效避免了非特异性扩增的干扰，在寄生虫检测中 非鱼类生物样品浮游植物、浮游动物采用不同网目
表现出显著优势。已有研究基于 18S rDNA 等保守 （具体网目规格根据目标类群调整）的纱绢网采
基因建立了锥虫、疟原虫等寄生虫的 qPCR 检测方 集，样品置于 10% 福尔马林溶液固定保存；甲壳
法，其灵敏度较常规 PCR 提升 10~100 倍，为早期 类生物则通过手抄网采集，用 75% 乙醇溶液固定
感染检测提供了可靠工具 [13-14] 。 保存。本实验得到福建省水产研究所科技伦理（审