Page 113 - 《渔业研究》2025年第5期

654 渔 业 研 究 第 47 卷

1
P<0.01 为差异极显著判断标准。使用 Graphpad 为 2.5×10 拷贝/µL（即 25 拷贝/µL）时，仍可观察
Prism 9.0 软件绘制标准曲线、扩增曲线及组织分布 到清晰的扩增曲线，且重复性良好；而当浓度降
0
柱状图。 至 2.5×10 拷贝/µL 时，则无明显扩增信号（图 5） 。
由此确定，该 qPCR 方法的检测下限为 25 拷贝/µL，
2 结果
表明其具有较高的灵敏度，可满足早期低剂量感染
2.1 虫体显微镜观察情况 检测需求。

取感染锥体虫的大黄鱼血液涂片，经吉姆萨染 4 500
色后在光学显微镜下观察（图 1） ，可见锥体虫呈 4 000
3 500
柳叶状，体长约 15~30 μm，前端尖细，后端稍 3 000 1 2 3 4 5 6 7
2 500
钝，具一根游离鞭毛沿虫体边缘延伸，运动时呈螺 荧光值 Fluorescence 2 000
旋状摆动。虫体在红细胞间穿梭，部分红细胞因受 1 500
1 000
虫体破坏而出现形态变形或破裂，进一步证实了锥 500
0
体虫对宿主血液系统的损伤作用。 −500
1 5 10 15 20 25 30 35 40
循环数
Cycles
图 2 荧光定量 PCR 扩增曲线
Fig. 2 Fluorescence quantitative PCR amplification curve
7
6
注：1~7 依次为质粒标准模板浓度 2.5×10 、2.5×10 、
2
1
2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 拷贝/µL） 。
3
4
5
Notes: 1－7 are plasmid standard template concentrations in
3
6
4
7
5
order 2.5×10 , 2.5×10 , 2.5×10 , 2.5×10 , 2.5×10 , 2.5×10 , 2
1
2.5×10 copies/µL）.

图 1 吉姆萨染色的血液锥鞭毛期光学显微镜照片
50
Fig. 1 Photomicrographs of bloodstream trypomastigotes 40
stained with Giemsa 30
循环阈值 Cycle threshold (CT)
2.2 标准曲线与扩增效率 20
10
以 10 倍梯度稀释的重组质粒标准品进行 qPCR 0
2 4 6 8 10 12
扩增，获得的扩增曲线呈现典型的“S”型，各浓度 log（质粒浓度）
梯度的扩增曲线间隔均匀，表明扩增效率稳定 log (Plasmid concentration)
（图 2） 。以标准品浓度对数为横坐标、Ct 值为纵 图 3 荧光定量 PCR 检测大黄鱼锥体虫的标准曲线
坐标构建标准曲线，其方程为 y=－3.262x+36.518， Fig. 3 Standard curve for the detection of Trypanosoma
相关系数 R =0.997，扩增效率为 103%，表明在 spp. by fluorescent quantitative PCR in L. crocea
2

1
7
2.5×10 ~2.5×10 拷贝/µL 浓度范围内，模板浓度与 3 500
3 000
Ct 值具有极强的线性关系（图 3） 。 2 500
2.3 特异性实验 荧光值 Fluorescence 2 000 1 2
1 500
以大黄鱼锥体虫阳性核酸、其他常见水产病原 1 000
核酸及空白对照进行特异性检测，结果显示仅大黄 500 0
−500
鱼锥体虫阳性样品及重组质粒标准品出现明显的特 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45
异性扩增曲线，Ct 值范围为 23.61~24.79；而车轮 循环数
Cycles
虫、刺激隐核虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌、神经坏死
图 4 大黄鱼锥体虫荧光定量 PCR 特异性检测结果
病毒、大黄鱼虹彩病毒等病原样品及空白对照均未
Fig. 4 Results of fluorescence quantitative PCR-specific
出现扩增曲线（图 4） ，表明该方法具有良好的特异
assay for Trypanosoma spp. in L. crocea
性，可有效区分大黄鱼锥体虫与其他常见水产病原。
注：1. 重组质粒；2. 大黄鱼锥体虫样品。
2.4 灵敏度实验
Notes: 1. Recombinant plasmids； 2. Trypanosoma spp.
灵敏度试验结果显示，当重组质粒模板浓度 from L. crocea.