Page 112 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 葛 辉等： 大黄鱼源锥体虫荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用 653

查）委员会审批同意，批准编号为 FRIF21-2509-01。 探针的特异性。
1.3 引物与探针设计 1.7 灵敏度试验
通过 GenBank 数据库检索锥体虫 18S rDNA 基 将阳性重组质粒进行 10 倍梯度稀释，获得浓
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因 序 列 （ 登 录 号 ： MH635421.1、 AB242274.1、 度为 2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 、
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AB242273.1、AB242276.1、AB242275.1、AF119810.1、 2.5×10 拷贝/µL 的系列模板，每个浓度设 3 次重
AF119809.1、AF119808.1、AF119807.1、AF119806.1、 复，按照上述反应条件进行扩增，以出现明显扩增
KY440343.1、KY440342.1、KJ690572.1、KU219950.1、 曲线的最低浓度为该方法的检测下限。
U17354.1） ，多序列对比后，在保守区域设计引物 1.8 重复性试验
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探针，使用 Primer Premier 5.0 软件设计特异性引 选取 2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 、2.5×10 拷贝/µL
物及 TaqMan 探针，引物与探针序列经 BLAST 比 的重组质粒标准品作为组内重复性测试样本；收集
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对验证，确保无其他物种同源序列。引物序列 ZTC- 大 黄 鱼 锥 体 虫 阳 性 样 品 （ 8.6×10 、 6.2×10 、
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F1：5’-TCAAGGATACCTTCCTCAATCA-3’ ；ZTC- 5.8×10 、4.3×10 拷贝/µL）作为批间测试的样本，
R1：5’-TGTCATCGTTTGCAGTGT-3’ 。扩增片段 进行组内和组间重复性试验。组内重复性：同批次
长度为 87 bp。探针 ZTC-P1-FAM：5’-TCTCTAATC- 实验中每个浓度设 3 次重复；组间重复性：不同批
ATCTTCGATCCCCACACT-3’，5’端标记荧光报告 次（间隔 3 d）实验中每个浓度设 3 次重复。计算
基团 FAM，3’端标记荧光淬灭基团 BHQ1。 各组 Ct 值的平均值（ ¯ x） 、标准差（SD）及变异
1.4 核酸提取 系数（CV=SD/ ¯ x×100%） ，评估方法的重复性与稳
取大黄鱼血液样品 100 μL，或组织样品（心 定性。
脏、脾脏、鳃等）约 20 mg，采用海洋动物组织基 1.9 组织趋向性分析
因组 DNA 提取试剂盒提取总核酸，具体操作严格 选取临床症状明显的患锥体虫病大黄鱼 5 尾，
按照试剂盒说明书进行。提取的核酸经核酸蛋白测 无菌条件下采集血液、心脏、脾脏、鳃、肝脏、体
肾、头肾、肠道、黏液共 9 种组织样品。每个组织
定仪检测浓度与纯度（OD 260 /OD 28 0 值应在 1.8~
2.0 之间） ，−20 ℃ 保存备用。 样品提取核酸后，按照建立的 qPCR 方法进行检
测，每个样品设 3 次重复。根据标准曲线计算各组
1.5 标准曲线建立
织中锥体虫的绝对含量（拷贝/µL 核酸） ，比较不
将 pMD18-T-锥体虫重组质粒用 TE 缓冲液进
同组织中锥体虫含量的差异。
行 10 倍 梯 度 稀 释 ， 获 得 浓 度 分 别 为 2.5×10 、
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1.10 大黄鱼及其他养殖鱼类、非鱼类样品检测
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2.5×10 、 2.5×10 、 2.5×10 、 2.5×10 、 2.5×10 、
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对采集自三都岛、霞浦、连江三个养殖海区
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2.5×10 拷贝/µL 的标准品。以各浓度标准品为模板
的 60 尾疑似患大黄鱼锥体虫的大黄鱼样品，取大
进行 qPCR 扩增，每个浓度设 3 次重复。反应体系
黄鱼血液样品 100 μL，组织样品（心脏、脾脏、
（20.0 μL） ：2×Taq Probe qPCR Mastermix 10.0 μL，
鳃等）约 20 mg，参照前文（1.4）基因组 DNA 提
上 、 下 游 引 物 （ 10.0 μmol/L） 各 0.8 μL， 探 针
取方法提取总核酸，采用相同的 qPCR 检测体系与
（10 μmol/L）0.4 μL，模板 DNA 2.0 μL，ddH O 程序（引物、反应条件同 1.5） ，检测各组织中锥
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补足至 20.0 μL。反应程序：95 ℃ 预变性 3 min；95 ℃
体虫的相对表达量。同时，取各组织制作石蜡切
变性 15 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，共 40 个循环，在
片：4% 多聚甲醛固定 48 h 后，经梯度脱水、二甲
退火延伸阶段收集荧光信号。以标准品浓度的对数 苯透明、石蜡包埋，切片厚度 5 μm，HE 染色后，
为横坐标、对应的 Ct 值为纵坐标，使用荧光定量 利用光学显微镜进行观察，记录组织病理变化，分
PCR 仪自带软件构建标准曲线。 析锥体虫在不同组织的感染分布。其他养殖鱼类、
1.6 特异性试验 非鱼类样品检测方法同 1.4、1.5。
将大黄鱼锥体虫、鱼类车轮虫、刺激隐核虫、 1.11 数据分析
副溶血弧菌、溶藻弧菌、神经坏死病毒以及大黄鱼 采用 IBM SPSS Statistics 21.0 软件进行数据统
虹彩病毒等阳性样品提取核酸作为特异性试验模 计分析，计量数值以“平均值±标准差（ ¯ x±SD） ”
板，以 ddH O 2 为空白对照，按照 1.5 的反应体系与 表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way
程序进行 qPCR 扩增，观察扩增曲线，判断引物与 ANOVA） ，组间两两比较采用 LSD-t 检验，以