Page 104 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 穆志新等： 大牡蛎弧菌 S2 胶原酶基因的克隆、表达及其对菲律宾蛤仔基因表达的调控 645

调至 0.5%，纤维凝胶蛋白的表达下调至 9.1%。基于 其 中 ， 下 调 蛋 白 显 著 富 集 于 DNA 重 组 、 DNA
差异表达基因的 GO 富集分析表明，胶原酶组与对 整合和 DNA 代谢等生物学过程，以及肌动蛋白
照组相比差异基因显著富集于 DNA 代谢、细 结合、细胞骨架蛋白结合等分子结合功能。KEGG
胞对 DNA 损伤刺激的响应、免疫应答、免疫系统 富集分析表明，胶原酶组菲律宾蛤仔中上调的
进程、细胞对胁迫的响应和胁迫响应等生物过程， 差异表达基因主要富集于四条 KEGG 信号通路，
细胞核相关基因等细胞组分，反向转运体活性、质 包括肌动蛋白细胞骨架调控通路、心肌收缩通路、
子跨膜转运活性、次级主动转运体活性、双链 DNA 心肌细胞肾上腺素能信号传导和 Apelin 信号通
结 合 、 RNA 酶 活 性 、 核 酸 酶 活 性 、 肌 动 蛋 白 路；胶原酶组菲律宾蛤仔中下调的差异表达基因主
结合、信号受体与配体互作等分子功能（图 4b） 。 要富集于肌动蛋白细胞骨架调控通路（图 4c） 。

a) M 1 2 3 4 5 6 7 8 b) M 1 2

35 kDa
25 kDa
35 kDa
25 kDa

图 2 胶原酶的表达与纯化
Fig. 2 Expression and purification of collagenase Col Vc
注：a）胶原酶表达菌株 BL21/pETcol V 的诱导表达；泳道 1. 未诱导菌体裂解液的上清液；泳道 2~4. IPTG 诱导 4、6 和 8 h
c
后菌体裂解液的上清液；泳道 5. 未诱导菌体的包涵体；泳道 6~8. IPTG 诱导 4、6 和 8 h 后菌体的包涵体。b）胶原酶复性后
纯化；泳道 1. 复性后的洗涤缓冲液；泳道 2. 复性后的洗脱缓冲液。M. 250 kDa 蛋白质分子量标准。
Notes: a) Induced expression of collagenase in the expression strain BL21/pETcol Vc ; Lane 1. Supernatant of uninduced bacterial
lysate; Lanes 2–4. Supernatant of bacterial lysate after IPTG induction for 4, 6, and 8 h; Lane 5. Inclusion bodies from uninduced
bacteria; Lanes 6–8. Inclusion bodies from bacteria after IPTG induction for 4, 6, and 8 h. b) Purification of refolded collagenase; Lane
1. Wash buffer after renaturation; Lane 2. Elution buffer after renaturation. M. 250 kDa protein marker.

a) i ii iii b) M 1 2 3 4 5 6 7 8 c)
存活率/% Survival rate 重组胶原酶 rCol Vc
180 kDa 100
130 kDa 80
100 kDa 60
70 kDa 40 对照 Control
55 kDa 20
40 kDa
35 kDa 0
2 4 6
时间/d Time
图 3 rCol V 的明胶降解活性及其致病性检测
c
Fig. 3 Gelatin degradation activity and pathogenicity assay of collagenase
注：a）明胶管检测胶原酶活性； （i）S2 菌液降解明胶； （ii）胶原酶降解明胶； （iii）洗脱缓冲液降解明胶。b）胶原
酶降解菲律宾蛤仔胶原蛋白；泳道 1. 仅胶原蛋白孵育 12 h；泳道 2. 仅胶原蛋白孵育 8 h；泳道 3. 仅胶原蛋白孵育 4 h；泳道
4. 仅胶原蛋白孵育 0 h（对照） ；泳道 5. rCol V 处理 0 h 后的胶原蛋白；泳道 6. rCol V 处理 4 h 后的胶原蛋白；泳道 7.
c
c
rCol V 处理 8 h 后的胶原蛋白；泳道 8. rCol V 处理 12 h 后的胶原蛋白。c）rCol V 注射后菲律宾蛤仔的存活率；对照组为注射
c
c
c
10 μL Tris-HCl 的菲律宾蛤仔；rCol V 组为注射 10 μL 胶原酶的菲律宾蛤仔。
c
Notes: a) Gelatin assay for collagenase activity; (i) Gelatin degradation by S2 bacterial culture; (ii) Gelatin degradation by
collagenase; (iii) Gelatin degradation by elution buffer. b) Collagenase degradation of Manila clam collagen; Lane 1. Collagen
incubated alone for 12 h; Lane 2. Collagen incubated alone for 8 h; Lane 3. Collagen incubated alone for 4 h; Lane 4. Collagen
incubated alone for 0 h (control); Lane 5. Collagen treated with collagenase for 0 h; Lane 6. Collagen treated with collagenase for 4 h;
Lane 7. Collagen treated with collagenase for 8 h; Lane 8. Collagen treated with collagenase for 12 h. c) Survival rate of Manila clam
after collagenase injection; Control group was the Manila clam injected with 10 μL Tris-HCl; Collagenase group was the Manila clam
injected with 10 μL collagenase.