Page 100 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 穆志新等： 大牡蛎弧菌 S2 胶原酶基因的克隆、表达及其对菲律宾蛤仔基因表达的调控 641

[6]
（V. aestuarianus）可感染太平洋牡蛎成体 ；塔 1 材料与方法
氏弧菌（V. tubiashii）可感染硬壳蛤（Mercenaria
mercenaria）幼虫 [7] ；解珊瑚弧菌（V. coralliily- 1.1 菌株、材料与方法
本实验所用菌株大牡蛎弧菌 S2 来自宁波大学海
ticus）可感染青口贝（Greenshell mussel）幼虫 ；
[8]
洋学院贝类营养与免疫实验室保存菌株，分离自发
蛤弧菌（V. tapetis）和大牡蛎弧菌可感染菲律宾蛤
仔 [9-10] 。除此之外，还有诺卡氏菌（Nocardia crassost- 病的菲律宾蛤仔浮游幼体；菲律宾蛤仔成体购自宁
波北仑大润发到家超市，平均壳长为（3.5±0.3）cm。
reae） [11] 、玫瑰变色菌（Roseovarius crassostreae） [12]
和立克次体（Rickettisa） [13] 等病原菌均可对贝类 实验所用质粒 pMD19-T、pET-28a (+) 以及分子生
物学试剂均购自 Takara（北京，中国） ；本实验中
造成威胁。
所用到的 DH5α 感受态细胞、BL21(DE3) 感受态细
弧菌属细菌的毒力因子包括铁载体、溶血素、分
胞均购自碧云天生物技术有限公司（上海，中国） 。
泌系统、外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）
250 kDa 蛋白质分子量标准购自上海雅酶生物医药
和胞外分泌物（Extracellular products，ECPs）等。
科技有限公司；实验所用的引物见表 1，均由有康
其中，ECPs 是弧菌重要的毒力因子，包括金属蛋
生物科技有限公司合成（杭州，中国） 。大牡蛎弧
白酶、胶原酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、
菌 S2 于 2216E 培养基中培养，培养基成分为 1 g
明胶酶和酪蛋白酶等 [14] 。ECPs 中的蛋白酶通过降
酵母提取物、5 g 胰蛋白胨、0.01 g 磷酸铁和 1 L 过
解宿主结构蛋白、干扰凝血系统、诱导细胞凋亡或
滤 海 水 。 大 肠 杆 菌 （ Escherichia coli） 于 Luria-
协同其他毒力因子，成为弧菌致病的关键因子 [15] 。
Bertani （LB）培养基中进行培养，培养基成分为
胶原酶是病原菌重要的胞外酶，能够降解宿主组织
5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨、10 g 氯化钠和 1 L
中的胶原蛋白等结构组成，进而破坏细胞外基质，
超纯水。DNA 提取试剂盒购自 Omega 生物技术有
削弱宿主的物理屏障功能，从而促进病原对宿主组
限公司（加利福尼亚，美国） 。BCA 蛋白浓度测
织的入侵及其在宿主中的扩散 [16-17] 。目前，多种弧
定试剂盒（C503051）购自生工生物工程（上海）
菌 如 拟 态 弧 菌 （ V. mimicu） 、 溶 藻 弧 菌 （ V.
股份有限公司（中国） 。明胶生化管（GB066）购
alginolyticus） 、 鳗 弧 菌 （ V. anguillarum） 、 海 神
自海博生物（青岛，中国） 。宁波大学实验动物伦
弧菌（V. neptunius） 、创伤弧菌（V. vulnificus）和
理委员会审批同意动物实验，批准编号为 2025。
灿烂弧菌中均已鉴定出胶原酶，并且证明了其与菌
表 1 本实验所用的引物
体致病性相关 [18-25] 。灿烂弧菌胶原酶可降解仿刺参
Tab. 1 The primers used in this experiment
（Apostichopus japonicus）的胶原蛋白，并下调免
引物 序列（5’—3’ ） 用途
疫相关通路，包括凋亡、溶酶体、吞噬体、泛素介 Primers Sequence (5’—3’ ) Purpose
导的蛋白质水解以及抗原加工提呈等相关基因，而 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
细菌鉴定
内吞作用通路中的相关基因则表现为上调 [25] 。溶 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT
藻弧菌胶原酶基因的敲除导致虎斑乌贼免疫相关通 M13-F GTCATAGCTGTTTCCTG
pMD19-T
路如 ErbB 信号通路和 JAK-STAT 信号通路中的相 M13-R GTAAAACGACGGCCAGT 通用引物
关基因呈现下调趋势，而内质网中的蛋白质加工过 T7-F АСАТССАСТТТGССТТТСТС
pET28-a(+)
程相关基因则上调 [26] 。 T7-R TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 通用引物
本 研 究 克 隆 了 大 牡 蛎 弧 菌 S2 胶 原 酶 基 因 coll-F GGATCCTGTGATGGTTGCTATGAA
基因克隆
col ，并构建 col 表达菌株，经诱导表达、纯化 coll-R CTCGAGTCACTGCTCTGAGGCCTG
c
V
Vc
获得重组胶原酶（Recombinant Col ，rCol ） ， 注：带下划线的序列为酶切位点。
Vc
Vc
提取菲律宾蛤仔胶原蛋白作为底物，检测了 rCol Vc Note: The underlined sequences are the enzymatic sites.

的胶原降解活性及其对菲律宾蛤仔的致病性。进一 1.2 大牡蛎弧菌 S2 胶原酶基因 col 的克隆及
c
V
步通过转录组分析了胶原酶对菲律宾蛤仔基因表达 序列分析
的调控作用，最后以胶原酶为靶标筛选了潜在的病 将大牡蛎弧菌 S2 接种于 2216E 液体培养基，28 ℃
害防控药物，以期为开发水产养殖中弧菌病害的靶 摇床震荡培养 16 h。通过 NCBI（https://www.ncbi.
向防控策略提供理论依据和技术支撑。 nlm.nih.gov/）获取大牡蛎弧菌的胶原酶基因序列及