Page 101 - 《渔业研究》2025年第5期

642 渔 业 研 究 第 47 卷

其对应的蛋白质序列（GenBank：CAK3875088.1） 。 20 min 后，倒掉考马斯亮蓝染色液，加入脱色液并
以 coll-F 和 coll-R 为引物，以大牡蛎弧菌 S2 基因 在水平摇床上进行脱色。最后，将聚丙烯酰胺凝胶
组 DNA 为模板，聚合酶链式反应（Polymerase 置于凝胶成像仪中观察拍照。
chain reaction，PCR）扩增无信号肽的胶原酶基因 将 100 mL 诱导后的菌液离心，收集菌体并重

colVc。PCR 产物经过 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，并于 悬于 5 mL 缓冲液 B 中，7 000 r/min 离心 20 min，收
凝胶成像仪（杭州申花，中国）中检测条带是否正确； 集上清液。将上清液加至 Ni-NTA 介质中孵育 1 h。缓
PCR 产物送至由杭州有康生物科技有限公司进行 冲液 C（10 mmol/LTris-HCl， 8 mol/L 尿素，pH=
测序。 6.3）洗涤后，将 Ni-NTA 和缓冲液 C 混合物置于透
通过 NCBI 进行序列的 BLAST 比对；利用 析袋中，于 1 L 含有梯度尿素的磷酸盐缓冲液
ClustaW 进行多序列比对，并结合 MEGA 11.0 构 （Phosphate buffer saline，PBS）透析： 6 mol/L 尿
建系统进化树；利用 SMART 进行结构域预测 素的 PBS 中透析 16 h，接着分别于含 4、2 和 1 mol/L
（http://smart.embl.de/） ；利用 SignalP 进行胶原酶信 尿素的 PBS 透析液透析 4 h，最后于不含尿素的
号肽预测（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） ； PBS 透析液中透析 12 h。取出含蛋白的 Ni-NTA 混
利用 SWISS 进行胶原酶三维结构预测（http://smart. 合液，于冰上使用洗涤缓冲液洗 4 次，最后使用洗
embl.de/） 。 脱缓冲液（50 mmol/L NaH PO ，300 mmol/L NaCl，
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1.3 胶原酶基因表达载体构建 250 mmol/L 咪唑，pH=8.0）洗脱。将各组分样品
通过引物 coll-F 和 coll-R 扩增无信号肽的胶原 进行 SDS-PAGE 电泳、染色和脱色，并于凝胶成
酶 col 基因，得到的胶原酶基因 DNA 片段与 像 仪 中 观 察 拍 照 。 胶 原 酶 的 浓 度 使 用 改 良 型
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载 体 pMD19-T 段 连 接 ， 构 建 质 粒 pMD19col ； BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行测定。
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pMD19col 经 c BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的胶 复性后的胶原酶活性使用明胶管进行检测：
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原酶 DNA 片段，与同样采用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ 酶 37 ℃ 水浴将明胶管中的明胶液化，将复性后的
切的 pET-28a (+) 连接，构建表达载体 pETcol 。 rCol V c 和 Tris-HCl 缓 冲 液 （ 含 5 mmol/L CaCl 2
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将 pETcol 转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细 和 10 μmol/L ZnCl ） 按 1∶1 的 比 例 混 合 。 取
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胞中，涂布于含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 固 100 μL 混合液加入液化明胶管中，封口膜封口后
体培养基平板上 37 ℃ 进行培养，获得表达菌株 置于 28 ℃ 培养箱孵育 24 h，然后置于 4 ℃ 冰箱
BL21/pETcol 。 0.5 h，最后观察明胶液化情况。
Vc
1.4 胶原酶的表达、纯化与复性 1.5 菲律宾蛤仔胶原蛋白提取
胶原酶的表达与复性按照 Zhang 等 [27] 的方 根据 Yan 等 [28] 方法进行菲律宾蛤仔胶原蛋白
法。按 1% 接种量将表达菌株 BL21/pETcol 接 的提取。解剖菲律宾蛤仔后，取出外套膜组织并剪
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种于含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，待 碎，加入 10 倍体积冰水后，使用磁力搅拌器匀速
菌液培养至 OD 60 0 为 0.5 左右时，加入终浓度为 搅拌 30 min；组织碎块于 0.1 mol/L Tris–HCl（pH=
0.4 mmol/L 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl- 8.0）缓冲液中继续匀速搅拌 8 h；8 000 r/min 离心
beta-D-thiogalactopyranoside， IPTG） ， 28 ℃ 继 续 10 min，取沉淀，继续采用 10 倍体积冰水重悬样
诱 导 4、 6 和 8 h 后 ， 分 别 取 出 菌 液 10 mL， 品并匀速搅拌 10 h；9 000 r/min 离心 20 min，取沉
12 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，收集菌体。使 淀，继续采用 10 倍体积的 0.1 mol/L NaOH 溶液与
用超声波仪器（JY88-IIN，宁波新芝生物公司，中 样品混匀以溶解非胶原成分，匀速搅拌 10 h，重
国）破碎菌体（功率 300 W，每次破碎 2 s，间隔 复 3 次；9 000 g 离心 20 min，取沉淀，并使用冰
10 s，工作 20 min） ，12 000 r/min 离心 30 min， 水反复洗涤至 pH 为 7.0；9 000 r/min 离心 20 min，
收集上清液，即为可溶性蛋白；同时对沉淀使用缓 将沉淀溶解于 10 倍体积的 0.5 mol/L 乙酸缓冲液
冲液 B（10 mmol/L Tris-HCl， 8 mol/L 尿素，pH=8.0） 中，缓慢加入 0.5% 胃蛋白酶， 匀速搅拌 48 h；
重悬 1 h，12 000 r/min 离心 30 min，离心收集上清 10 000 r/min 离心 30 min，取上清液，缓慢加入
液，即为包涵体蛋白。将可溶性蛋白和包涵体蛋白 NaCl，至终浓度 0.8 mol/L，继续匀速搅拌 8 h；
同时进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 10 000 r/min 离心 30 min，将沉淀使用 0.5 mol/L
（SDS-PAGE）电泳，使用考马斯亮蓝染色液染色 乙 酸 浴 液 溶 解 ； 将 提 取 物 置 于 1 L 20 mmol/L