Page 102 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 穆志新等： 大牡蛎弧菌 S2 胶原酶基因的克隆、表达及其对菲律宾蛤仔基因表达的调控 643

Na HPO 缓冲液（pH=8.0）透析 56 h；透析后的 1.9 胶原酶抑制剂的筛选
4
2
溶液即为纯化的胶原蛋白。胶原蛋白的浓度使用改 小分子药物苯扎氯氨、盐酸巴马汀、2’-羟基
良型 BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行测定。 查尔酮、氯己定、核黄素和原花青素是已报道的蛋
1.6 胶原酶降解胶原蛋白分析 白酶抑制剂 [29] 。在本实验中，将上述物质和姜黄
按照 Li 等 [25] 的方法进行胶原酶降解胶原实 素选作受试药物进行抑制胶原酶活性的检测。 将
验。将菲律宾蛤仔胶原蛋白和胶原酶以 15∶1 的体 12.5 μL 明 胶 溶 液 （ 20 mg/mL） 、 125 μL Tris-
积比混合至 Tris-HCl 缓冲液中（含 5 mmol/L CaCl 2 HCl、5 μL 胶原酶溶液和终浓度 0.1 mmol/L 药物溶
和 10 μmmol/L ZnCl ） ，分 4 组并分别于 28 ℃ 孵 液混合，28 ℃ 孵育 40 min；向混合物中加入 125 μL
2
育 0、4、8 和 12 h，同时使用等体积的洗脱缓冲液 10% 三氯乙酸、225 μL 乙酸缓冲液（pH=5.4）和
代替胶原酶与胶原蛋白混合，在相同条件下孵育作 250 μL 茚三酮，沸水中孵育 10 min，立即置于冰水
为对照组。孵育结束后，将每组样品于 8% SDS- 中冷却；向混合物中加入 500 mL 60% 乙醇，使用酶
PAGE 凝胶中电泳，观察降解条带。 标仪测定其在 570 nm 的吸光值 （杭州奥盛，中国） 。
1.7 rCol c 攻毒实验 1.10 分子对接实验
V
菲律宾蛤仔于海水中暂养 1 d 后进行实验，实 使 用 SWISS 进 行 胶 原 酶 三 维 结 构 的 预 测
验温度为 22 ℃ 左右，每天换水 1 次，使用金藻每 （http://smart.embl.de/） ，于 PubChem 数据库中获
天喂养 2 次。将菲律宾蛤仔分为 6 组，其中 3 组注 取小分子药物苯扎氯氨、盐酸巴马汀、2’-羟基查
射 rCol ，另外 3 组注射缓冲液作为对照组，每组 尔酮、氯己定、姜黄素、核黄素和原花青素的三维
Vc
含有 10 只菲律宾蛤仔。将 rCol c 和 Tris–HCl 缓冲
V 结构（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） ；在 Auto-
液按 1∶1（V/V）的比例混合后，再将 10 μL 混合
DockTools 中导入配体和受体的文件，利用 AutoDock
液和 10 μL Tris-HCl 缓冲液分别注射至菲律宾蛤仔
Vina 进行分子对接。
体内，每天观察并记录其死亡情况。
1.11 数据统计分析
1.8 转录组测序与分析
统计分析使用 GraphPad Prism 软件（10.1.2 版
分别取胶原酶注射组和对照组的菲律宾蛤仔，
本）进行。所有实验数据均以平均值±标准差
解剖后取出鳃组织，无菌 PBS 洗涤后置于 2 mL
（Mean ± SD）形式表示。所有比较分析的统计学
EP 管中，液氮速冻后提取 RNA。质量控制、完整
显著性设定为 P < 0.05。
性检测后，使用带有 polyT 寡核苷酸的磁珠分离纯
化 mRNA。经片段化处理后，首先使用随机六聚 2 结果
体引物合成第一链 cDNA，随后合成第二链 cDNA。
2.1 大牡蛎弧菌 S2 胶原酶基因 colVc 的克隆
文库构建依次通过末端修复、加 A 尾、接头连
大牡蛎弧菌 S2 的胶原酶基因序列全长为 834 bp，
接、片段大小筛选、扩增和纯化完成。最终通过
共编码 277 个氨基酸（图 1a） ，预测的蛋白分子
Qubit 荧光定量仪和实时定量 PCR 进行浓度检测，
量约为 32 kDa。系统进化分析表明，大牡蛎弧菌
并利用生物分析仪（Bioanalyzer）验证片段大小分
S2 胶 原 酶 基 因 与 溶 珊 瑚 弧 菌 （ V. coralliirubri）
布，随后于 Illumina 平台进行测序。使用参考基因
的胶原酶聚为一支，与其他弧菌胶原酶亦具有同源
组 （ GCA_964294305.1_xbRudPhil6.1_genomic.fna.
性（图 1b） 。但 SMART 结构域分析表明，该胶
gz）进行新转录本预测。对原始的 readcount 数据
进行标准化处理，以校正测序深度差异。接着，应 原酶基因仅含有典型的信号肽结构，无保守的肽酶
用统计学模型计算假设检验概率（P value） ，并通 结构域（图 1c） ，因此大牡蛎弧菌 S2 胶原酶可能
过多重假设检验校正获得错误发现率值，筛选出在 为一类结构新颖的胶原酶。
不同状态下表达水平显著差异的基因。功能和通路 2.2 胶原酶的降解活性及其致病性
c
富集分析：使用 Cluster Profiler 软件对差异表达基 经 IPTG 诱导后，表达菌株 BL21/pETcol 可
V
因进行 Gene Ontology（GO）功能和 Kyoto Encyclo- 大量表达胶原酶，但是表达产物以包涵体形式存在
pedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分 （图 2a） ，不具有生物学活性。利用 Ni–NTA 亲和
析。转录组测序和分析均由北京诺禾致源有限公司 层析柱对带有 His 标签的 rCol V c 进行纯化并复性
完成。 （图 2b） 。其蛋白浓度为 27.53 μg/mL。