Page 41 - 《渔业研究》2025年第3期

298 渔 业 研 究 第 47 卷

2 结果 藻保持阳性，而短凯伦藻由阴性转为阳性。此外，

RAA-LbCas12a 的检测结果与显微镜观察及测序−
2.1 基于现场赤潮样品的验证分析
系统发育分析结果一致。尽管显微镜观察与系统发
如表 1 所示，光学显微镜计数结果显示，赤潮
育分析表明该赤潮样品中存在着大量的非靶标物
样品中的优势种分别为东海原甲藻（Prorocentrum
种, 且其他凯伦藻科藻类（如指沟卡尔藻和长沟凯
3
donghaiense，6.85×10 个/mL） 、指沟卡尔藻（K. di-
gitatum，1.90×10 个/mL）和凯伦藻（Karenia sp.， 伦藻）占据了相当部分的生物量，这些藻类与米氏
3
8.5×10 个/mL） 。图 4 展示了利用光学显微镜拍摄 凯伦藻和短凯伦藻具有高度的同源性，但 RAA-
3
的赤潮藻细胞图像，除东海原甲藻和指沟卡尔藻 LbCas12a 依然能在短凯伦藻（10 个/mL）仅占加
外，还检测到了米氏凯伦藻和长沟凯伦藻（K. longi- 标样品细胞总量 0.1% 的情况下，精准识别出米氏
canalis）的存在；然而，未发现剧毒卡尔藻和短凯 凯伦藻和短凯伦藻。这些结果表明，RAA-LbCas12a
伦藻或与其形态类似的藻种。由于这些凯伦藻科缺 在赤潮藻种检测中具有高度的特异性和灵敏性。

乏明显的细胞壁板结构，其在光学显微镜下的形态 表 1 在光学显微镜观察下，福建省连江县现场赤潮水
特征容易受环境因素影响而表现出多样性，特别是 样中的优势藻种及其密度
在使用鲁格固定剂后，细胞形变更加明显。因此， Tab. 1 The dominant microalgae species and density in
red tide water samples collected from Lianjiang, Fujian
仅依靠光学显微镜难以在物种水平上进行准确鉴
Province through microscopic observation
定。为进一步确认赤潮水样中的藻种信息，本研究
优势种 学名 拉丁名 密度/（10 个/mL）
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进行克隆分析鉴定（图 5） ，发现了 3 种有毒藻种 Dominant species Scientific name Latin name Density/(10 cells/mL)
3
（指沟卡尔藻、米氏凯伦藻和长沟凯伦藻）以及 第一优势种
The first 东海原甲藻 P. donghaiense 6.85
3 种无毒藻种 [ 垂裂莱万藻（Levanderina fissa） 、 dominant species
第二优势种
东海原甲藻和阿米巴藻（Amoebophrya sp.）]，然 The second 指沟卡尔藻 K. digitatum 1.90
dominant species
而未检测到剧毒卡尔藻和短凯伦藻。
第三优势种
米氏凯伦藻和短凯伦藻均隶属于裸甲藻目（Gy- The third 凯伦藻 Karenia sp. 0.85
dominant species
mnodiniales） 、凯伦藻科（Kareniaceae） 、凯伦藻

属（Karenia） ，在 rDNA 序列和 ITS 序列上表现
出高度同源性 [16] 。相比之下，剧毒卡尔藻虽属于裸
甲藻目凯伦藻科，但归属卡尔藻属（Karlodinium） ，
在形态大小上与米氏凯伦藻和短凯伦藻存在显著差
异。剧毒卡尔藻长 11.1~18.7 μm，宽 8.2~14.7 μm。
25 μmol/L 1 25 μmol/L 2
而米氏凯伦藻长 20~30 μm，宽 16~30 μm；短凯伦
藻长 23~34 μm，宽 24~36 μm。基于赤潮样品的现
场验证分析，本研究重点选择分子特征和形态特征
更为相似的米氏凯伦藻和短凯伦藻为研究对象，以
评估 RAA-LbCas12a 检测技术的综合性能（图 6） 。
实验结果显示，RAA-LbCas12a 成功地检测到了样
25 μmol/L 3 25 μmol/L 4
品中的米氏凯伦藻（图 6，样品 1） ，检测结果为
阳性。对于短凯伦藻（图 6，样品 2）和阴性对照 图 4 在光学显微镜拍摄下的福建省连江县现场赤潮水
样中的赤潮藻种图像
（图 6，样品 NC） ，检测结果均为阴性。随后，
Fig. 4 Optical microscope image of microalgae in red tide
将 1 mL 密度为 500 个/mL 的短凯伦藻细胞培养物
water samples collected from Lianjiang, Fujian Province
加入到 49 mL 环境样品中，制备出短凯伦藻浓度
注：1. 东海原甲藻；2. 指沟卡尔藻；3. 米氏凯伦藻；
为 10 个/mL 的加标样品，并再次对米氏凯伦藻
4. 长沟凯伦藻。
（图 6，样品 3）和短凯伦藻（图 6，样品 4）进
Notes: 1. P. donghaiense; 2. K. digitatum; 3. K. mikimotoi;
行 RAA-LbCas12a 检测。检测结果显示，米氏凯伦 4. K. longicanalis.