Page 44 - 《渔业研究》2025年第3期

第 3 期 吴隐生等： 基于 RAA-LbCas12a 技术的有毒（害）赤潮快速检测产品应用效果评估 301

表 3 RAA-LbCas12a 检测、胶体金免疫快检试纸条检测和显微镜观察在连江黄歧湾的检测结果汇总
Tab. 3 Summary of the testing results on RAA-LbCas12a detection, colloidal gold immunochromatography rapid test
strips detection, and microscopic observation in Huangqi Bay, Lianjiang
RAA-LbCas12a 检测 胶体金免疫快检试纸条检测
日期 RAA-LbCas12a detection Colloidal gold immunochromatographic rapid test strips detection 显微镜观察
Microscopic
Date
米氏凯伦藻 剧毒卡尔藻 短凯伦藻 米氏凯伦藻 塔玛亚历山大藻 链状裸甲藻 observation
K. mikimotoi K. veneficum K. brevis K. mikimotoi A. tamarense G. catenatum
中肋骨条藻
04-10 − − − / / /
Skeletonema costatum
针杆藻
04-19 − − − / / /
Synedra sp.
斜纹藻
04-26 − − − / / /
Pleurosigma sp.
05-03 − − − − − − 中肋骨条藻
05-10 + − − + − − 甲藻
角毛藻
05-18 − − − − − −
Chaetoceros sp.
凯伦藻 Karenia sp.、多
05-24 + − + − − − 环旋沟藻 、夜光藻
Noctiluca scintillans
05-31 − − − − − − 中肋骨条藻
06-07 − − − − − − 拟菱形藻
中肋骨条藻、东海原甲
06-15 + − + / / /
藻、凯伦藻
3 讨论 度、高特异性的分子检测方法。如基于聚合酶链式
反应（Polymerase chain reaction，PCR）的实时荧
在近岸海域，凯伦藻科引发的赤潮常导致大量
光定量 PCR（Real-time quantitative polymerase chain
野生和养殖的鱼类、贝类及软体动物死亡，严重威
reaction，qPCR）和多重 PCR（Multiple polymerase
胁海洋生态系统安全和沿海居民健康。凯伦藻科
chain reaction，mPCR），以及以环介导等温扩增（Lo-
（甲藻纲）于 2005 年正式建立，由凯伦藻属、卡
op-mediated isothermal amplification，LAMP） [25-27] 、
尔藻属和塔卡藻属（Takayama）3 个属组成 [17] 。凯
超分支滚环扩增（Hyper-rolling cycle amplification，
伦藻属中的许多藻类属于有毒有害种，其中危害较 [28] [29]
大的包括米氏凯伦藻和短凯伦藻 [18] 。例如，自 HRCA） 和 RAA 为代表的核酸等温扩增技
1948 年以来，短凯伦藻在美国佛罗里达州频繁引 术。qPCR 可以根据单个细胞中靶基因的拷贝数估
发赤潮，对环境和人类健康造成了严重影响 [19] ； 算水体中藻细胞的数量，已被广泛用于定性检测水
而米氏凯伦藻在 2005 年至 2018 年间，在中国沿海 体中的各种赤潮藻种，如链状亚历山大藻（Alexan-
引发了近 100 起赤潮，造成直接经济损失约 4 亿美 drium catenella） 、米氏凯伦藻和拟菱形藻等 [30-32] 。
元 [18] 。剧毒卡尔藻是卡尔藻属中研究较深入的物 mPCR 通过在扩增体系中加入多对引物，能够在单
种之一，其产生的毒素已被证实具有较强的溶血毒 个 mPCR 体系中对多个靶标进行检测，极大地提
性 [20] ，能够导致鱼类、贝类、鸟类和哺乳动物死 高了检测效率。但为避免因多对引物引起的非特异
亡。剧毒卡尔藻广泛分布于中国沿海海域，在浙 性扩增，mPCR 对引物设计要求较高。此外，qPCR
江、山东、福建等地多次引起赤潮，并严重地影响 和 mPCR 的设备昂贵且依赖于较为复杂的样品前
了当地的贝类养殖业 [21-23] 。目前尚未有塔卡藻属在 处理过程，不能满足藻种现场检测的需求。等温扩
中国引起鱼类死亡的报道，且尚无实质性证据证明 增技术的出现降低了对复杂反应设备的依赖，使核
其存在毒性 [24] 。因此，本研究选择米氏凯伦藻、 酸检测可在恒温条件下快速完成。然而这些技术仍
剧毒卡尔藻和短凯伦藻作为代表性物种，对赤潮藻 存在局限性。例如，LAMP 需要较高的扩增温度
种快速现场检测技术 RAA-LbCas12 进行实际应用 （60~65 °C）和终止反应温度（80 °C） ，且引物
测试。 特异性不足易引发假阳性 [33] 。同样，HRCA 因需
针对赤潮带来的威胁，核酸扩增检测技术已在 要在 65、95、80 °C 之间频繁切换，且反应时间较
藻种检测中得到广泛应用，发展出了一系列高灵敏 长（超过 150 min） ，在现场应用受到了限制。为