Page 45 - 《渔业研究》2025年第3期
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              了避免上述限制，本研究引入 RAA 技术以优化目                         中高效提取     DNA  的关键环节。传统方法通常使用
              标扩增，并结合        LbCas12a 进行精准检测。RAA        技      DNA  浓缩柱或试剂盒提取高纯度            DNA，不仅成本
              术仅需    1  对引物，在    37 °C  下即可高效运行，在赤             高昂，且因步骤复杂延长了检测时间。为此，本团
              潮藻种的现场快速检测中展现出极大的应用潜力。                           队在快速检测工具箱中采用了一种廉价、组分简单
                  先前研究已利用目标藻种的纯种细胞培养物                          的快速裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；
              对  RAA-LbCas12a 系统的特异性和灵敏性进行了初                   25 mmol/L NaCl；2.5 mmol/L EDTA；0.05% SDS） ，
              步评估   [10-11] 。然而，实际水样的化学组成和生物组                  用于制备    DNA  粗提物，并结合        RAA-LbCas12a 技
              成极为复杂，不仅含有多种有机物和无机物（如微                           术进行检测。尽管         DNA  纯度较低，但该方法在靶
                                           2+
                                    2+
                               3+
              塑料、抗生素、Fe 、Ca 、Mg 和             SO 等化学物          细胞浓度低至       1  个/mL  时仍能准确检测目标藻种。
                                                 2−
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              质） ，而且含有多种微生物，包括各类细菌、真                           在连江和平潭的试点应用中，该系统表现出高度可
              菌、原生动物以及其他微型藻类和目标物种。在这                           行性，验证了其与快速裂解缓冲液的良好兼容性。
              些复杂条件下，RAA-LbCas12a 系统的综合表现尚                     相比传统提取方法，快速裂解缓冲液法具有以下优
              不明确。鉴于此，针对天然水样，尤其是赤潮水                            势：1）操作简单，步骤精简；2）减少危险材料的
              样，进行     RAA-LbCas12a 分析尤为必要。本团队成                使用；3）无需专用设备，为赤潮藻种检测提供了
              功地检测到了现场赤潮样品中的米氏凯伦藻，而短                           一种高效、经济的解决方案。
              凯伦藻检测结果则为阴性。这与该赤潮水样的形态                               综上所述，RAA-LbCas12a 检测技术在对赤潮
              学、测序和系统发育分析结果一致。对于添加了短                           水样的检测分析和试点应用中，表现出了高特异

              凯伦藻的标准样品（10           个/mL） ，检测结果呈阳              性、高灵敏性以及出色的可靠性，在赤潮藻种的现
              性，表明     RAA-LbCas12a 能够识别赤潮水样中微量                场检测中具有广泛的适用性。该技术有效弥补了多
              的短凯伦藻。尽管该水样中含有高密度的非靶标物                           年来赤潮检测工作中藻种鉴定手段的不足，对提升
              种（9.6×10 个/mL） ，且存在着数量可观的多种同                     海洋渔业的赤潮防灾减灾能力以及促进渔业经济的
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              源物种（米氏凯伦藻、长沟凯伦藻、指沟卡尔藻） 。                         持续健康发展具有重要意义。此外，该技术操作简
              在试点应用中，RAA-LbCas12a 技术展现了高度的                     便，通过便携式快检工具箱即可在                90 min  内完成
              特异性，在多次检测中能够准确区分同一属内的不                           现场实时检测，无需依赖大型、昂贵的检测设备或
              同藻种，如米氏凯伦藻和短凯伦藻。在                   60  次的检      高技能技术人员，特别适用于近岸赤潮高发区域的
              测中，RAA-LbCas12a 结果与基于胶体金免疫的赤                     常规监测与应急检测。
              潮藻种快检试纸条和显微镜观察结果基本一致，且
              未出现明显的假阳性现象，证明了该技术在实际应                           参考文献（References） ：
              用中的可靠性。这些结果进一步表明               RAA-LbCas12a     ［  1  ］   俞志明，陈楠生. 国内外赤潮的发展趋势与研究热
              检测技术在藻种的现场检测应用中具有高度的特异                                点  [J]. 海洋与湖沼，2019，50（3） ：474 − 486.
              性和灵敏性。RAA-LbCas12a 的高度特异性主要归                          Yu Z M, Chen N S. Emerging trends in red tide and ma-
              因于   LbCas12a 系统中   crRNAs 对靶标核酸的精确                   jor  research  progresses[J].  Oceanologia  et  Limnologia
              互补。根据      Kleinstiver 等 [34]  的研究结果，crRNAs           Sinica, 2019, 50(3): 474 − 486.
              和靶标序列之间的任何错配都会显著削弱                  LbCas12a    ［  2  ］   Wurtsbaugh  W  A,  Paerl  H  W,  Dodds  W  K.  Nutrients,
              的切割活性，特别是当前间隔序列邻近基序（Proto-                            eutrophication and harmful algal blooms along the fresh-
              spacer adjacent motif，PAM）后的间隔区中的前       8  个         water  to  marine  continuum[J].  WIREs  Water,  2019,
              核苷酸存在单碱基错配时，LbCas12a 的单链                DNA           6(5): e1373.
              反式切割活性将不会被激活。相较于单一的                     RAA     ［  3  ］   Gobler C J. Climate change and harmful algal blooms:
              检测，RAA-LbCas12a 技术能够识别单个碱基差异，                         insights  and  perspective[J].  Harmful  Algae,  2020,  91:
              大幅提高了检测特异性。而             RAA  对于靶标核酸的                 101731.
              快速扩增则提高了检测系统的灵敏性，使得其即使                          ［  4  ］   Huisman J, Codd G A, Paerl H W, et al. Cyanobacterial
              在低藻细胞浓度下，也能有效捕捉到靶标核酸。                                 blooms[J]. Nature Reviews Microbiology, 2018, 16(8):
                  随着赤潮藻种快速检测技术的发展，多种核酸                              471 − 483.
              扩增方法相继出现，但许多研究忽视了从环境样品                          ［  5  ］   Kouakou C R C, Poder T G. Economic impact of harmful
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