Page 50 - 《渔业研究》2025年第3期

第 3 期 陈财珍等： 石油烃污染胁迫下中肋骨条藻蛋白质组学研究 307

性效应，给海洋生态环境和渔业资源带来严重危 Reagent-8Plex Multiplex Kit：Biosystems 公司；其
害；石油烃对海洋微藻的光合作用有显著影响，包 他试剂均为国产分析纯。

括降低叶绿素 a 含量、影响各项叶绿素荧光参数和 1.2 仪器与设备
降低羧化酶活性等；石油污染形成的油膜会阻碍水 紫外分光光度计：美国 Varian 公司；振荡
体的复氧作用，这些直接关系到海洋微藻的生长和 器：德国 Wiggens 公司；恒温光照培养箱：上海精
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繁殖，进而影响整个海洋生态系统的平衡 。 宏实验设备有限公司；全自动高压灭菌锅：致微
中肋骨条藻（Skeletonema costatum）属于中心 （厦门）仪器有限公司；生物显微镜 Leica DM
硅藻纲（Coscinodiscophyceae） 、骨条藻科（Skeleto- 4500B：德国 Leica 公司；四位数机械式手动金属
nemaceae） ，是常见的浮游植物种类，为广温广盐 计数器：美国百赛施（BYXAS） ；5804R 离心机：
的典型代表，其对毒物敏感、易获得、个体小、繁 Eppendorf 公司；Milli-Q 纯水机：Millipore 公司；
殖快，能被用来评价较短时间化合物对其许多世代 超声细胞破碎仪：索尼公司；电泳仪：BIO-RAD
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及种群水平的影响，是一种很好的测试生物 。 公司；酶联免疫仪：BIO-RAD 公司；高效液相色谱：
蛋白质组学主要是指在外界环境条件下的细 SHIMADZU 公司；超高效液相色谱：AB SCIEX 公
胞、组织、器官、个体以及物种等在特定时刻表达 司；质谱：AB SCIEX 公司；扫描仪：UMAX 公司。

1.3 方法
出的全套蛋白质，对各蛋白质的变化进行定量分
析，能够动态监测细胞、菌体的生物调控和复杂代 1.3.1 WAF 母液的制备
在 500 mL 分液漏斗中加入过滤灭菌的海水和
谢功能，从而在蛋白质水平上获得细胞代谢过程的
0 柴油，体积比为 9∶1，用振荡器以 230 r/min 振
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整体认识 。随着新的环境污染物的发现和污染物
荡 8 h，然后静置 12 h 进行分层，分离的下层水相
质分析的痕量化、复杂化、多样化，环境科学研究
即为实验用 WAF 母液。需要注意的是，在制备期
者们在依靠传统分子生物学技术发现低浓度、低胁
间，要处于避光状态，同时在 4 ℃ 条件下保存
迫和多应激反应机制诱导的标志物的基础上，利用
WAF 母液，并依据 GB 17378.4—2007《海洋监测
蛋白质组学更进一步地从遗传信息的表达水平和代
规范 第 4 部分：海水分析》中石油类的测定方法，
谢通路水平上了解污染胁迫机理 [10] 。因此，本研
测定其浓度。
究利用双向凝胶电泳、质谱分析、稳定同位素标记
1.3.2 急性毒性处理与慢性毒性处理 [11]
和生物信息学分析等蛋白质组学技术，研究石油烃
将中肋骨条藻培养在恒温光照培养箱中，采
污染胁迫下中肋骨条藻的差异表达蛋白（Differently
用 f/2 营养液配方，培养条件为温度（20±2）℃，
expressed proteins，DEPs） ，为其致毒机理在分子
明暗周期为 12 h·12 h，光源为白色日光灯，强度约为
水平上的研究奠定基础，也为评估石油烃对海洋环
4 000 lx。藻液初始藻细胞密度为 2.2×10 个/mL。
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境的风险和预警提供基础数据和科学依据。
急性毒性处理时间一般控制在 96 h 以内，但

1 材料与方法 根据周永欣等 [12] 的藻类急性毒性试验方法可知，
如果藻类仍有明显生长，试验时间可延长至 7 d，

1.1 材料与试剂
因此在本实验室条件下，急性毒性处理是持续在石
中肋骨条藻由厦门大学环境与生态学院提供；
油烃浓度为 3.0 mg/L 的培养液中培养 6 d；慢性毒
#
0 柴油：厦门市东渡加油站提供；培养基：f/2 培 性处理是持续在石油烃浓度为 3.0 mg/L 的培养液
养液；海水取自厦门市前埔附近海域；正己烷为色 中培养 3 个月。具体为在 500 mL 具塞玻璃三角瓶
谱纯：美国 Tedia 公司；油标准物质 GBW （CE） 中，分别加入不同体积的 WAF 母液和 f/2 培养液，
1080913（1 000 mg/L） ：国家海洋环境监测中心； 石油烃浓度为 3.0 mg/L，总体积为 300 mL。其中
蛋白质标准品：分子量为 10 000~250 000 Da，Fer- 对照组只加入过滤海水和 f/2 培养液，其他实验和
mentas 公司；乙腈、甲酸：美国 Tedia 公司；1×磷 检测过程与处理组一样。对照组设置 2 个平行，急
酸盐（PBS）缓冲液、三氯乙酰酸丙酮、乙二胺四 性毒性处理组和慢性毒性处理组设置 3 个平行。
乙酸、三羟基甲氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl） 、十 收集新鲜藻液至 100 mL 离心管中，8 000 r/min，
二烷基硫酸钠、四甲基乙二胺、丙烯酰胺、四乙基 4 ℃ 条件下离心 5 min，弃上清液，收集沉淀，沉
溴化铵（TEAB） 、二巯基苏糖醇（DTT） 、苯甲 淀按 1∶1（W∶V）溶解于 1×PBS 缓冲液中，置

基磺酰氟化物、过硫酸铵：Sigma-Aldrich 公司； 于−70 ℃ 冰箱中保存，用于差异表达蛋白分析。