Page 51 - 《渔业研究》2025年第3期
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308                                  渔  业  研  究                                     第 47 卷

              1.3.3 蛋白质提取                                      质组的   GO  注释,并使用     KEGG  数据库(http://www.
                  使用滤膜辅助样品制备(Filter-aided sample               genome.jp/kegg/)进行通路分析。GO        和  KEGG  的
              preparation,FASP) [13]  酶解方法进行酶解;将酶              富集分析根据       Fisher 精确检验进行,显著性水平
              解好的肽段冻干。用十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺                           P     为  0.05。
              凝胶电泳鉴定提取的蛋白。
                                                               2 结果与分析

              1.3.4 同重同位素相对与绝对定量(Isobaric tags
              for  relative  and  absolute  quantitation, iTRAQ)  2.1 差异表达蛋白(DEPs)数据分析
              试验                                                   将提取的蛋白质通过          iTRAQ  试验,经    RPLC-
                  将冻干的肽段用        30 μL 0.5 mol/L TEAB  进行溶     MS  分析、标准生物信息分析,本研究共检测到                 1 723
                             ®
              解,取出     iTRAQ  Reagent-8Plex Multiplex Kit,每    个蛋白质,有定量信息的蛋白质个数为                   1 682  个。
              组样品对应      1  个分子量。将标记试剂离心,分别加                   以差异倍数值变化超过           1.2  倍作为显著上调,小于
              入  70 μL  异丙醇,震荡混匀后高速离心,然后加入                     0.833  倍作为显著下调的变化标准,所有差异表达
              到各自对应酶解液中,充分混匀离心,室温静置反                           蛋白汇总数据见图        1,慢性毒性处理组与对照组间
              应     2 h。                                       的差异表达蛋白有        112  个,其中表达量上调        49  个,
              1.3.5 一维高    pH  反相分离和反相液质联用          RPLC-      表达量下调     63  个;急性毒性处理组与对照组间的
              MS  分析肽的检测                                       差异表达蛋白有        169  个,其中表达量上调         81  个,
                                                               表达量下调     88  个。从图    2  中可知,急性毒性和慢
                  1)一维高     pH  反相分离
                                                               性毒性处理组间有         40  个共同的差异表达蛋白,其
                  A  相 : 20  mmol/L  甲 酸 铵 , pH  10; B  相 :
                                                               中慢性毒性处理组有          72  个特有的差异表达蛋白,
              20 mmol/L  甲酸铵,100%ACN,pH 10;紫外检测
                                                               急性毒性处理组有          129  个特有的差异表达蛋白。
              波长:214 nm/280 nm;流速:200 μL/min;根据峰
                                                               对  40  个共有的差异表达蛋白进行亚细胞结构定位
              型和时间共收取        12  个梯度,真空离心浓缩后,用
                                                               分析,结果见表       1,半数交集差异表达蛋白定位到
              50 μL RPLC A  相(5%ACN、0.1%    甲酸)溶解,进
                                                               了叶绿体,而叶绿体为重要的光合作用细胞器,因
              行第二维分析。
                                                               此可以推测毒性处理后对中肋骨条藻的光合作用有
                  2)反相液质联用        RPLC-MS
                                                               很大的影响。
                  富集柱:自制       C18,5 μm,ID100 μm,20 mm
                                                                     120  上调差异表达蛋白 Up-regulated DEPs
              Length;分离柱:自制      C18,3 μm,ID75 μm,120 mm                  下调差异表达蛋白 Down-regulated DEPs
                                                                                            81   88
                                                                     100
              Length;色谱条件:色谱分离时间:90 min;A:
              5% ACN,0.1%   甲酸;B:95% ACN,0.1%        甲酸;              80     49  63
              流速:300 nL/min;质谱鉴定:MS          扫描范围(m/z)              数量 Number  60
              350~1 250,累积时间    0.25 s,MS/MS  扫描范围(m/z)               40
              100~1 500,扫描模式:HS       高灵敏度模式,累积时
                                                                      20
              间  0.1 s,IDA  采集模式,1    个  MS1  图谱选择    20  个
                                                                      0
              最强的母离子进行串级扫描。                                                   2-vs-1         3-vs-1

                                                                                 组间 Between groups
              1.3.6 数据处理
                  质谱产生的原始数据          wiff 和  scan  文件通过  MS                  图 1    差异表达蛋白
              data converter V1.3(AB Sciex)转化为   mgf 文件,              Fig. 1    Differentially expressed proteins
              然后导入     mascot 2.5.1  进行搜索,将     mascot 生产         注:1  为对照组;2    为慢性毒性处理组;3       为急性毒性
                                                               处理组;vs 表示相比。图      2  同此。
              的  dat 文件导入到    Scaffold_4.3.2  进行定量分析。
                                                                  Notes:  1  is  the  control  group;  2  is  the  chronic  toxicity

              1.3.7 数据库搜索和生物信息学分析                              group; 3 is the acute toxicity group; vs is short for versus. It’s
                  利用   MASCOT2.5  引擎(Matrix Science 公司)        the same as figure 2.

              对从质谱获得的原始数据进行搜索,搜索对象为美                           2.2 急性毒性和慢性毒性处理的差异表达蛋白
              国国家生物技术信息中心(NCBI)的硅藻门(Bacil-                     GO  富集分析
              lariophyta)数据库。使用     Blast 2 Go  程序从  UniProt-      对不同处理组的上调和下调差异表达蛋白分别

              GO  数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)获得蛋白           进行  GO  富集分析,通过图        3  和图  4  可以看出,急
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