Page 51 - 《渔业研究》2025年第3期
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308 渔 业 研 究 第 47 卷
1.3.3 蛋白质提取 质组的 GO 注释，并使用 KEGG 数据库（http://www.
使用滤膜辅助样品制备（Filter-aided sample genome.jp/kegg/）进行通路分析。GO 和 KEGG 的
preparation，FASP） [13] 酶解方法进行酶解；将酶 富集分析根据 Fisher 精确检验进行，显著性水平
解好的肽段冻干。用十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺 P 为 0.05。
凝胶电泳鉴定提取的蛋白。
2 结果与分析
1.3.4 同重同位素相对与绝对定量（Isobaric tags
for relative and absolute quantitation， iTRAQ） 2.1 差异表达蛋白（DEPs）数据分析
试验 将提取的蛋白质通过 iTRAQ 试验，经 RPLC-
将冻干的肽段用 30 μL 0.5 mol/L TEAB 进行溶 MS 分析、标准生物信息分析，本研究共检测到 1 723
®
解，取出 iTRAQ Reagent-8Plex Multiplex Kit，每 个蛋白质，有定量信息的蛋白质个数为 1 682 个。
组样品对应 1 个分子量。将标记试剂离心，分别加 以差异倍数值变化超过 1.2 倍作为显著上调，小于
入 70 μL 异丙醇，震荡混匀后高速离心，然后加入 0.833 倍作为显著下调的变化标准，所有差异表达
到各自对应酶解液中，充分混匀离心，室温静置反 蛋白汇总数据见图 1，慢性毒性处理组与对照组间
应 2 h。 的差异表达蛋白有 112 个，其中表达量上调 49 个，
1.3.5 一维高 pH 反相分离和反相液质联用 RPLC- 表达量下调 63 个；急性毒性处理组与对照组间的
MS 分析肽的检测 差异表达蛋白有 169 个，其中表达量上调 81 个，
表达量下调 88 个。从图 2 中可知，急性毒性和慢
1）一维高 pH 反相分离
性毒性处理组间有 40 个共同的差异表达蛋白，其
A 相 ： 20 mmol/L 甲 酸 铵 ， pH 10； B 相 ：
中慢性毒性处理组有 72 个特有的差异表达蛋白，
20 mmol/L 甲酸铵，100%ACN，pH 10；紫外检测
急性毒性处理组有 129 个特有的差异表达蛋白。
波长：214 nm/280 nm；流速：200 μL/min；根据峰
对 40 个共有的差异表达蛋白进行亚细胞结构定位
型和时间共收取 12 个梯度，真空离心浓缩后，用
分析，结果见表 1，半数交集差异表达蛋白定位到
50 μL RPLC A 相（5%ACN、0.1% 甲酸）溶解，进
了叶绿体，而叶绿体为重要的光合作用细胞器，因
行第二维分析。
此可以推测毒性处理后对中肋骨条藻的光合作用有
2）反相液质联用 RPLC-MS
很大的影响。
富集柱：自制 C18，5 μm，ID100 μm，20 mm
120 上调差异表达蛋白 Up-regulated DEPs
Length；分离柱：自制 C18，3 μm，ID75 μm，120 mm 下调差异表达蛋白 Down-regulated DEPs
81 88
100
Length；色谱条件：色谱分离时间：90 min；A：
5% ACN，0.1% 甲酸；B：95% ACN，0.1% 甲酸； 80 49 63
流速：300 nL/min；质谱鉴定：MS 扫描范围（m/z） 数量 Number 60
350~1 250，累积时间 0.25 s，MS/MS 扫描范围（m/z） 40
100~1 500，扫描模式：HS 高灵敏度模式，累积时
20
间 0.1 s，IDA 采集模式，1 个 MS1 图谱选择 20 个
0
最强的母离子进行串级扫描。 2-vs-1 3-vs-1
组间 Between groups
1.3.6 数据处理
质谱产生的原始数据 wiff 和 scan 文件通过 MS 图 1 差异表达蛋白
data converter V1.3（AB Sciex）转化为 mgf 文件， Fig. 1 Differentially expressed proteins
然后导入 mascot 2.5.1 进行搜索，将 mascot 生产 注：1 为对照组；2 为慢性毒性处理组；3 为急性毒性
处理组；vs 表示相比。图 2 同此。
的 dat 文件导入到 Scaffold_4.3.2 进行定量分析。
Notes: 1 is the control group; 2 is the chronic toxicity
1.3.7 数据库搜索和生物信息学分析 group; 3 is the acute toxicity group; vs is short for versus. It’s
利用 MASCOT2.5 引擎（Matrix Science 公司） the same as figure 2.
对从质谱获得的原始数据进行搜索，搜索对象为美 2.2 急性毒性和慢性毒性处理的差异表达蛋白
国国家生物技术信息中心（NCBI）的硅藻门（Bacil- GO 富集分析
lariophyta）数据库。使用 Blast 2 Go 程序从 UniProt- 对不同处理组的上调和下调差异表达蛋白分别
GO 数据库（http://www.ebi.ac.uk/GOA/）获得蛋白 进行 GO 富集分析，通过图 3 和图 4 可以看出，急
