Page 51 - 《渔业研究》2025年第3期
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308 渔 业 研 究 第 47 卷
1.3.3 蛋白质提取 质组的 GO 注释,并使用 KEGG 数据库(http://www.
使用滤膜辅助样品制备(Filter-aided sample genome.jp/kegg/)进行通路分析。GO 和 KEGG 的
preparation,FASP) [13] 酶解方法进行酶解;将酶 富集分析根据 Fisher 精确检验进行,显著性水平
解好的肽段冻干。用十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺 P 为 0.05。
凝胶电泳鉴定提取的蛋白。
2 结果与分析
1.3.4 同重同位素相对与绝对定量(Isobaric tags
for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 2.1 差异表达蛋白(DEPs)数据分析
试验 将提取的蛋白质通过 iTRAQ 试验,经 RPLC-
将冻干的肽段用 30 μL 0.5 mol/L TEAB 进行溶 MS 分析、标准生物信息分析,本研究共检测到 1 723
®
解,取出 iTRAQ Reagent-8Plex Multiplex Kit,每 个蛋白质,有定量信息的蛋白质个数为 1 682 个。
组样品对应 1 个分子量。将标记试剂离心,分别加 以差异倍数值变化超过 1.2 倍作为显著上调,小于
入 70 μL 异丙醇,震荡混匀后高速离心,然后加入 0.833 倍作为显著下调的变化标准,所有差异表达
到各自对应酶解液中,充分混匀离心,室温静置反 蛋白汇总数据见图 1,慢性毒性处理组与对照组间
应 2 h。 的差异表达蛋白有 112 个,其中表达量上调 49 个,
1.3.5 一维高 pH 反相分离和反相液质联用 RPLC- 表达量下调 63 个;急性毒性处理组与对照组间的
MS 分析肽的检测 差异表达蛋白有 169 个,其中表达量上调 81 个,
表达量下调 88 个。从图 2 中可知,急性毒性和慢
1)一维高 pH 反相分离
性毒性处理组间有 40 个共同的差异表达蛋白,其
A 相 : 20 mmol/L 甲 酸 铵 , pH 10; B 相 :
中慢性毒性处理组有 72 个特有的差异表达蛋白,
20 mmol/L 甲酸铵,100%ACN,pH 10;紫外检测
急性毒性处理组有 129 个特有的差异表达蛋白。
波长:214 nm/280 nm;流速:200 μL/min;根据峰
对 40 个共有的差异表达蛋白进行亚细胞结构定位
型和时间共收取 12 个梯度,真空离心浓缩后,用
分析,结果见表 1,半数交集差异表达蛋白定位到
50 μL RPLC A 相(5%ACN、0.1% 甲酸)溶解,进
了叶绿体,而叶绿体为重要的光合作用细胞器,因
行第二维分析。
此可以推测毒性处理后对中肋骨条藻的光合作用有
2)反相液质联用 RPLC-MS
很大的影响。
富集柱:自制 C18,5 μm,ID100 μm,20 mm
120 上调差异表达蛋白 Up-regulated DEPs
Length;分离柱:自制 C18,3 μm,ID75 μm,120 mm 下调差异表达蛋白 Down-regulated DEPs
81 88
100
Length;色谱条件:色谱分离时间:90 min;A:
5% ACN,0.1% 甲酸;B:95% ACN,0.1% 甲酸; 80 49 63
流速:300 nL/min;质谱鉴定:MS 扫描范围(m/z) 数量 Number 60
350~1 250,累积时间 0.25 s,MS/MS 扫描范围(m/z) 40
100~1 500,扫描模式:HS 高灵敏度模式,累积时
20
间 0.1 s,IDA 采集模式,1 个 MS1 图谱选择 20 个
0
最强的母离子进行串级扫描。 2-vs-1 3-vs-1
组间 Between groups
1.3.6 数据处理
质谱产生的原始数据 wiff 和 scan 文件通过 MS 图 1 差异表达蛋白
data converter V1.3(AB Sciex)转化为 mgf 文件, Fig. 1 Differentially expressed proteins
然后导入 mascot 2.5.1 进行搜索,将 mascot 生产 注:1 为对照组;2 为慢性毒性处理组;3 为急性毒性
处理组;vs 表示相比。图 2 同此。
的 dat 文件导入到 Scaffold_4.3.2 进行定量分析。
Notes: 1 is the control group; 2 is the chronic toxicity
1.3.7 数据库搜索和生物信息学分析 group; 3 is the acute toxicity group; vs is short for versus. It’s
利用 MASCOT2.5 引擎(Matrix Science 公司) the same as figure 2.
对从质谱获得的原始数据进行搜索,搜索对象为美 2.2 急性毒性和慢性毒性处理的差异表达蛋白
国国家生物技术信息中心(NCBI)的硅藻门(Bacil- GO 富集分析
lariophyta)数据库。使用 Blast 2 Go 程序从 UniProt- 对不同处理组的上调和下调差异表达蛋白分别
GO 数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)获得蛋白 进行 GO 富集分析,通过图 3 和图 4 可以看出,急