Page 40 - 《渔业研究》2025年第3期
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第 3 期       吴隐生等： 基于      RAA-LbCas12a  技术的有毒（害）赤潮快速检测产品应用效果评估                         297

              LbCas12a 未能在检测样品中发现靶标物种                DNA，      载体（TaKaRa ） ，构建重组质粒，并转化至感受
              因此未能激活报告基团显色，结果判定为阴性。                            态大肠杆菌细胞中。随机挑选了               55  个克隆，送往
              3）无效：若检测线与质控线位置均未出现红色条                           生工生物工程（上海）有限公司进行测序。测序结
              带，提示检测过程中可能操作不当或试纸条已失                            果通过    NCBI 数据库（National Center for Biotech-
              效，建议重新进行检测。                                      nology  Information， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）

              1.4 胶体金免疫层析检测流程                                  进行  BLAST  比对分析。序列比对及手动调整使用
                  基于胶体金免疫技术的赤潮快速检测试纸条由                         MEGA 11.0  软件完成，并采用邻接法（Neighbor-
              厦门大学     Fang  等 [12-13] 、Li 等 [14]  制备并提供。在检    joining，NJ）进行系统发育分析，进行               1 000  次
              测过程中，首先将待测水样充分混匀，然后吸取                            bootstrap  重复抽样，以评估分支支持度。

              60 μL  样品，无需预处理，直接滴加到试纸条的样                       1.5.4 连江赤潮水样       RAA-LbCas12a 检测
              品垫上。在      5~10 min  内，根据检测线和质控线是                    赤潮水样混匀后，按照          1.2  所示方法，取    50 mL
              否出现红色条带进行结果判读。具体判读标准如                            样品进行检测。同时，将             1 mL  靶标藻种培养物
              下：若质控线和检测线均在              10 min  内出现红色条         （500  个/mL）加入到     49 mL  样品中，以制备靶细
              带，则结果为阳性，表明样品中赤潮藻浓度高于检                           胞浓度为     10  个/mL  的阳性加标对照样本。对于
              测限；若仅质控线出现红色条带而检测线不显色，                           RAA-LbCas12a 检测的阴性对照实验，则以无酶水
              则结果为阴性，表明样品中赤潮藻浓度低于检测限                           代替  DNA  模板进行检测。

              或不存在相应藻类；若质控线未显色，则表明试纸                           1.6 RAA-LbCas12a 分子快检的试点应用
              条无效，需重新进行检测。                                         为评估   RAA-LbCas12a 方法在实际应用中的综

              1.5 基于现场赤潮样品的产品验证                                合性能，本研究于        2024  年  4  月  10  日至  2024  年  6  月

              1.5.1 现场赤潮样品采集                                   15  日，在连江黄歧湾（26.317449°N、119.821438°E）
                                                               和 平 潭 桃 澳 底 澳 （ 25.635253°N、 119.748664°E）
                  为评估    RAA-LbCas12a 在化学组分和生物组分
                                                               （图  3）开展了为期       65 d  的赤潮藻种分子快检试点
              更加复杂的赤潮水样中的性能，本研究于                    2024  年
                                                               应用。按照      1.2  和  1.3  的方法，分别对水样进行
              5  月  20  日从福建省连江县采集了赤潮样品，并进
                                                               RAA-LbCas12a 检测、胶体金免疫层析检测以及显
              行了   RAA-LbCas12a 检测。为验证该方法对赤潮水
                                                               微镜观察。
              样的检测准确性，本研究同时采用光学显微镜对样
                                                                    N
              品进行了鉴定与计数，获得了水样中优势物种的图
              像信息与生物密度数据。此外，还对赤潮水样的基
              因组   DNA  进行了测序和系统发育分析，以确认靶                                            Huangqi Bay, Lianjiang
              标藻种及其他藻种的存在情况。
                                                                 26.2°

              1.5.2 显微镜观察
                  藻细胞计数采用显微镜结合浮游生物计数框进
              行。取   1 mL  样品，加入   10 μL  鲁格试剂（0.602 mol/L
              KI；10% CH COOH；0.197 mol/L I）以固定藻细                 26.0°
                          3
              胞，并在光学显微镜（Leica，DMi1）下观察、计
              数和拍摄图像。当浮游生物浓度较低时，通过截留
              法从   250 mL  现场样品中富集浮游生物，并将其洗
              脱至   50 mL  人工海水中。将浓缩后的           1 mL  样品转
                                                                 25.8°
              移至浮游生物计数框，在光学显微镜下分别以
              100  倍和  400  倍放大倍率进行细胞观察。

              1.5.3 分子克隆分析
                                                                                      Tao’aodi’ao Bay, Pingtan
                  将赤潮样品中的细胞富集于聚碳酸酯薄膜滤膜
                                                                 25.6°
              上，按照     CTAB  法提取样本      DNA。随后，使用通                  119.5° 119.6° 119.7° 119.8° 119.9° 120.0° 120.1° E
              用引物    18ScomF-3end  和  com28R1  扩增包含   ITS1/         图 3    连江黄歧湾和平潭桃澳底澳采样站位图
              5.8S/ITS2  以及部分   SSU  和  LSU rDNA  的  DNA  片     Fig. 3    Geographic distribution of sampling stations in
              段（约    1.5 kb） [15] 。PCR  产物连接至   pMD™ 19-T      Huangqi Bay of Lianjiang and Tao’aodi’ao Bay of Pingtan
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