Page 38 - 《渔业研究》2025年第3期
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第 3 期       吴隐生等： 基于      RAA-LbCas12a  技术的有毒（害）赤潮快速检测产品应用效果评估                         295

              快速健康发展构成了严重制约。2001               年—2020  年，      1 材料与方法
              福建省共记录       236  起赤潮事件，年均发生次数为
                                                               1.1 RAA-LbCas12a 检测原理
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              11.8  次，年均影响面积为         628.7 km ，年均累计持
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              续时间为     62.9 d，其中   2009  年福建省因赤潮灾害
                                                               在  37 ℃  恒温条件下，利用        RAA  技术对样品中微
              造成的直接经济损失达             0.65  亿元；2012  年高达
                                          [7]
              20.11  亿元；2019  年达  0.31  亿元 。鉴于赤潮的突             量靶标核酸进行高效扩增（约              10 min） ；随后，在
              发性和危害性，为最大程度减轻其对水产养殖行业                           crRNA  的引导下，由扩增子激活           LbCas12a 的反式
              的负面影响，在近岸海域开展日常监测并建立完善                           降解活性，对标记有生物素和羟基荧光素的单链
              的赤潮预警系统显得尤为重要。                                   DNA  探针进行无差别剪切（反应时间约                1 h） ；最
                  传统的赤潮藻种鉴定主要依赖于光学显微镜对                         后，利用含有生物素抗体和羟基荧光素抗体的侧流
              细胞形态的观察与分析，这种方法对监测人员的分                           层析试纸条进行检测结果的可视化判读（约                 10 min） 。
              类学知识和藻种鉴定经验有较高要求。然而，该方                           前期研究中，本团队以米氏凯伦藻（Karenia miki-
              法不仅耗时且操作繁琐，还易因人为因素导致错检，                          motoi） 、剧毒卡尔藻（Karlodinium veneficum）和
              尤其是在属以下水平区分不同藻种时，准确性显著                           短凯伦藻（K. brevis）为代表种，基于其内转录间
              受限。相比之下，核酸检测技术基于核酸序列的多                           隔区（Internal transcribed spacer，ITS ）设计并筛
              样性，通过识别物种特异性区域，实现目标物种的                           选了针对    3  个藻种的   RAA  引物对和    crRNA。

              精准鉴定。该技术具有高灵敏度和准确性，特别适                           1.2 RAA-LbCas12a 分子快速检测产品集成
              用于赤潮藻种的早期精确诊断。重组酶介导等温核                               RAA-LbCas12a 检测技术的操作流程简单、反
              酸扩增（Recombinase aided amplification，RAA）是        应快速，在赤潮藻种快速检测中具有一定的优势。
              一种恒温快速核酸扩增技术，克服了对热循环设备                           该方法无需依赖大型仪器设备，仅需一个简单的金
              的依赖，操作简单，无需专业技能即可完成，在                    37~     属孵育器或恒温水浴锅，在            37 ℃  下于  90 min  内即
              42 ℃  的恒定温度下可在        5~20 min  内快速扩增靶标
                                                               可完成单个样品的检测。图           2  展示了  RAA-LbCas12a
                                                        [8]
              基因。RAA     技术已被广泛用于病原微生物的检测 ，
                                                               便携式快速检测工具箱，检测人员可依托该工具箱
              但在藻种检测领域的研究和应用仍较少，尚有较大
                                                               高效开展藻种的现场检测工作。工具箱内配备了所
              开发潜力。
                                                               有必要的试剂和一次性耗材：1）10 μL               和  200 μL
                  在核酸扩增之后，扩增产物的分析同样至关重
                                                               吸头；2）10 μL    和  200 μL  移液枪；3）滤头、滤膜、
              要。LbCas12a 是一种来源于细菌的            DNA  核酸内切
                                                               和针筒；4）剪刀、镊子和           1.5 mL  离心管；5）RAA
              酶，它能够在特异性         crRNA  的引导下精准识别并切
                                                               扩增试剂盒（杭州众测生物科技有限公司，S001ZC） ；
              割靶标    DNA，同时激活其反式降解活性，将非特
                                                               6）LbCas12a 核酸酶和     crRNA；7）侧流层析试纸
                                                        [9]
              异性单链     DNA  分子降解为单核苷酸或双核苷酸 。
                                                               条（Milenia HybriDetect 1，TwistDxTM） 。
              基于这一特性，本团队将           RAA  与  LbCas12a 相结合，
              开发了一套用于赤潮藻种现场快速检测的技术。该                           1.3 RAA-LbCas12a 方法检测流程

                                                               1.3.1 DNA  粗提物制备
              方法的细胞检测灵敏度均可达到               1  个/mL，且具备
              高度特异性，未与其临近藻种或同海域常见藻种发                               通过针筒过滤，将样品中的靶细胞富集在聚
              生交叉反应     [10-11] ，为赤潮藻种的快速现场检测提供                碳酸酯滤膜表面（3 μm         孔径，25 mm     直径） 。随
              了可靠且高效的解决方案。                                     后，将滤膜剪碎并转移至含有              500 μL  快速裂解液
                  然而，与大多数赤潮藻种检测技术类似，本团队                        （ 20  mmol/L  Tris-Cl， pH  8.0； 25  mmol/L  NaCl；
              开发的    RAA-LbCas12a 检测方法目前仍处于实验室                 2.5 mmol/L EDTA；0.05% SDS）的离心管中，裂
              研发阶段，其在实际水体中的现场应用效果尚需进                           解液中包含有      0.5 mm  直径的氧化锆磁珠，以辅助
              一步验证。因此，本研究通过在福建省平潭县和连                           藻细胞破碎。剧烈振荡离心管               10 s，从而获得用
              江县开展为期      65 d  的现场测试，利用已有的         RAA  引     于     RAA-LbCas12a 分析的  DNA  粗提物。
              物和   crRNA  对水体中的米氏凯伦藻、剧毒卡尔藻                     1.3.2 RAA  扩增与    LbCas12a 识别
              和短凯伦藻进行检测，以评估              RAA-LbCas12a 技术           RAA  反应试剂购自杭州众测生物科技有限公司，
              在现场快速检测赤潮藻种方面的可行性和应用潜力。                          每个  RAA  冻干粉管中加入       25 µL A  缓冲液、2.5 µL
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