Page 39 - 《渔业研究》2025年第3期

296 渔 业 研 究 第 47 卷

B 缓冲液、各 2 µL 正向和反向引物（10 µmol/L） ， 应混合液转移至不同 PCR 管中，并加入 1 µL DNA
并用无酶水定容至 50 µL。随后，取 19 µL RAA 反 粗提取物。充分混匀后，在 37 °C 孵育 10 min。

吸收垫
Absorption pad
阴性 Negative
非靶标基因 Non-target genes Interpretation area
判读区
结合垫
Binding pad

靶标基因 Target genes

阳性 Positive
检测线
Test line
质控线
Control line

LbCas12a crRNA: FB 探针:
FB probe

基因组 DNA 粗提 RAA 扩增 LbCas12a 酶切 侧流层析试纸条检测
Genomic DNA crude extraction Recombinase aided amplification LbCas12a enzyme digestion Lateral flow strips detection
(≤10 min) 37 ℃, 10 min 37 ℃, 1 h (≤10 min)
图 1 RAA-LbCas12a 检测原理示意图
Fig. 1 Schematic illustration of RAA-LbCas12a-based detection

图 2 RAA-LbCas12a 便携式快速检测箱
Fig. 2 RAA-LbCas12a portable rapid detection box

为了验证 RAA 扩增结果，本研究采用基于 等待约 2 min 后读取测试结果。本研究所使用的
LbCas12a 的可视化检测方法分析扩增子。LbCas12a RAA 引物、crRNA 和探针均源自先前研究，并由
检测反应体系如下：1 µL LbCas12a（1 µmol/L） 、1 µL 生工生物工程（上海）有限公司合成 [10-11] 。

TM
crRNAs（10 ng/µL） 、2 µL 10 × NEBuffer r2.1、 1.3.3 结果判读
0.2 µL FB 报告探针（100 µmol/L）以及 2 µL RAA RAA-LbCas12a 侧流层析纸条结果判读如图 1
扩增子，并用无酶水定容至 20 µL。在 37 °C 条件 所示。1）阳性：当检测线与质控线位置均出现红
下孵育 1 h 后，将反应产物与 100 µL HybriDetect 色条带，或仅检测线位置出现红色条带而质控线无
试剂缓冲液（TwistDxTM）混合，在室温下孵育 条带时，表明 LbCas12a 成功识别了靶标物种 DNA，
2 min。最后，将得到的混合液滴加在侧流层析纸 激活报告基团显色，结果判定为阳性。2）阴性：
条的吸收垫上（Milenia HybriDetect 1, TwistDxTM） ， 仅质控线出现红色条带而检测线未显色，表明