Page 57 - 《水产学报》2026年第2期
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2 期           杨清麟，等：三角帆蚌         NQO1  基因的克隆、表达及其与         Nrf2  信号通路的调控关系               50 卷

              在  2  个潜在的    HcNrf2  结合位点 (ARE1：−518 ~          蛋白浓度进行定量分析，随后将蛋白样品在                   100 ℃
              −532；ARE2：−463 ~ −476)。为验证该预测，本                  加热  10 min  进行变性处理。变性后的蛋白样品通
              研究采用重叠        PCR  技术，分别构建了          ARE1和       过  10% SDS-PAGE  进行分离，通过电转印法转移
              ARE2  的单突变 (NQO1-MUT1、NQO1-MUT2) 及               至  PVDF  膜上。为降低非特异性结合，将                PVDF
              双突变 (NQO1-MUT1+MUT2) 荧光素酶报告质粒。                   膜置于含    5%  脱脂奶粉的封闭液中，在            37 ℃  条件
              突变序列通过生物信息学分析后设计，确保突变                            下封闭    2 h。封闭后的膜与预先制备的              HcNQO1
              位点不会与      HcNrf2  结合。突变的具体方法：分别                 多克隆抗体 (用      TBST  缓冲液按     1∶1 000  比例稀
              以  NP3-fluF/MUT1R  和  NfluR/MUT1F  为引物，进         释) 在  4 ℃  条件下孵育过夜。使用辣根过氧化物
              行两轮独立       PCR  反应；将等摩尔的         PCR  产物混       酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠         IgG  二抗在室温下孵
              合、稀释，并以         NP3-fluF/NfluR  为引物进行第二          育  2 h。蛋白条带使用化学发光成像系统进行检测。
              轮  PCR，扩增获得携带突变位点的目的片段                    [19] 。
                                                                1.10    数据分析
              采用相同策略，以单突变质粒为模板，构建双突
                                                                   实验数据采用       SPSS 26.0  统计软件进行单因
              变质粒。如前所述，通过双荧光素酶报告基因实
                                                               素方差分析 (One-Way ANOVA)，并通过           Tukey  事
              验检测    HcNrf2  对突变后启动子的转录调控活性。
                                                               后多重比较检验评估组间差异的显著性。所有数
               1.8    原核表达及多克隆抗体制备
                                                               据均以平均值±标准差 (mean ± SD) 表示，显著性
                   为实现   HcNQO1   蛋白的表达和抗体制备，本                 水平设定为     P<0.05。Western blot 图像的条带灰度
              研究将    HcNQO1  基因片段亚克隆至         pMD19-T载体        值通过    Image J 软件进行定量分析。图表绘制使
              中，通过     BamH I 和  EcoR I 双酶切处理，将其定              用  GraphPad Prism 10.0  软件完成。
              向插入    pET-30a (+) 原核表达载体。重组质粒经转
                                                                2    结果
              化进入大肠杆菌         DH5α  感受态细胞后，通过筛选
              获得阳性克隆，并进一步转化至大肠杆菌                      BL21
                                                                2.1    HcNQO1  基因的克隆及序列分析
              (DE3) 感受态细胞中表达。为启动蛋白表达，在
              37 ℃  下将含有    pET30a-NQO1  重组质粒的大肠杆菌                 本研究通过三角帆蚌转录组数据库筛选获得
              BL21 (DE3) 置于添加卡那霉素 (终浓度            50 µg/mL)    NQO1  基因候选序列，采用          5'-和  3'-RACE  技术对
              的  LB  液 体 培 养 基 中 培 养 。 当 培 养 液     OD 60 0  达  该片段进行延伸扩增，经双向测序验证后获得目
              0.6  时，加入终浓度为        1 mmol/L的异丙基-β-D-硫          标序列。该序列总长          1 005 bp，包含   45 bp  的  5'非
              代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 进行诱导表达              4 h。表达        翻译区 (UTR)、795 bp     的  ORF  以及  165 bp  的  3'
                                               2+
              产物经    SDS-PAGE  验证后，采用        Ni 亲和层析纯          UTR (图  1-a)。第三轮   RACE  扩增产物电泳结果显
              化，通过二喹啉甲酸 (BCA) 法测定总蛋白浓度。                        示，5'端片段实际扩增长度为             384 bp (预测大小为
                   选择   4~6  周雌性  KM  小鼠，以      100 µL  重组     353 bp)，3'端片段为     501 bp (预测大小为     479 bp)
              HcNQO1  蛋白溶液 (1 mg/mL) 为抗原，采用弗氏                  (图  1-b，c)。通过   NCBI 数据库    BLAST  比对分析，
              完全佐剂 (首次免疫) 和弗氏不完全佐剂 (后续免                        确认该序列与已知         NQO1  基因序列具有高度同源
              疫) 进行皮下多点免疫来制备              HcNQO1  多克隆抗         性，遂将其命名为        HcNQO1。
              体。末次免疫       7 d  后采血，分离血清，−80 ℃        保存。
                                                                2.2    HcNQO1  系统发育树分析
              抗体特异性通过蛋白免疫印迹 (Western blot) 验证。
                                                                   基 于  MEGA  11.0  构 建 的 系 统 发 育 树 中 ，
               1.9    蛋白质提取、SDS-PAGE        和  Western blot
                                                               HcNQO1  与双壳类中的砂海螂 (Mya arenaria) 和蚌
              分析
                                                               蛎 (Mercenaria mercenaria) NQO1  聚为一支 (自展
                   采用  KZ-II 高速组织匀浆器 (武汉赛维尔生物                  支持率>90%)，而与紫贻贝 (Mytilus edulis)、厚壳
              科技有限公司) 在冰冷的           RIPA  裂解缓冲液 (含蛋           贻贝 (M. coruscus) 遗传距离较远，表明其系统发
              白酶抑制剂混合物) 中对组织进行匀浆 (70 Hz，10                     育地位符合双壳类的分类特征 (图              2)。
              min)。组织匀浆液在        4 ℃  条件下以    12 000 r/min  离      MEME   在线工具预测的        9  个保守   motif 分析
              心  10 min，收集上清液即总蛋白。采用              BCA  法对      表明，多数物种       NQO1  蛋白  N  端由  motif 1  和  motif

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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