Page 55 - 《水产学报》2026年第2期
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2 期           杨清麟，等：三角帆蚌         NQO1  基因的克隆、表达及其与         Nrf2  信号通路的调控关系               50 卷

              3000  转染试剂 (Invitrogen，美国)；DMEM       培养基        healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/) 评估蛋白理
              和 胎 牛 血 清  (GIBCO， 美 国 )； RNAiso  Plus 总         化性质；SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.
                                       ®
              RNA  提取试剂、SMARTer  RACE cDNA          合成试        dk/services/SignalP-6.0/) 预测信号肽；采用    MEGA
              剂盒及    PCR  相关试剂 (TaKaRa，日本)、大肠杆菌                11.0  构建基于   Dayhoff 模型的系统发育树，并通
              (Escherichia coli) DH5α  和  BL21 (DE3) 感受态细胞     过  1 000  次  Bootstrap  检验评估系统发育拓扑结构
              (北京酷来搏科技有限公司)；RT-qPCR               预混液与         的置信度。
              双荧光素酶检测试剂盒            [ 翌圣生物科技      (上海) 股
                                                                1.5    RT-qPCR  分析
              份有限公司      ]；原核表达诱导剂、抗生素及               RIPA
                                                                   本实验通过       RT-qPCR  技术检测     HcNQO1 在
              裂解液 (上海碧云天生物技术股份有限公司)；弗
                                                               不同组织中的表达差异。总             RNA  经反转录试剂盒
              氏佐剂 (Sigma-Aldrich，美国)。
                                                               (Hifair  III，含  gDNA  酶) 逆转录成   cDNA  后，以
                                                                    ®
               1.2    总  RNA  提取和  cDNA  合成
                                                               其 为 模 板 ， 使 用    Hieff  UNICON   Universal  Blue
                                                                                             ®
                   采用  RNAiso Plus 按标准流程提取三角帆蚌的                qPCR SYBR Green Master Mix，在  Bio-Rad CFX96
                                             ®
              肝胰腺总      RNA，经    Nanodrop 2000 测定  OD 260/280  Real-Time PCR  系统中进行    RT-qPCR  反应。实验
              值为   1.8 ~ 2.0 者用于后续实验。使用          SMARTer  ®    过程中所采用的扩增体系及反应程序均依据本课
              RACE 5'/3' Kit 合成  cDNA  第一链，产物分装储存              题组前期优化确立的实验方案进行设置 。该引
                                                                                                   [18]
              于−80 ℃  超低温冰箱备用。                                 物扩增效率为       105.47%，以EF1α   为内参基因，采
                                                               用 2 −∆∆C t 法计算  HcNQO1  相对表达量。
               1.3    HcNQO1 cDNA  的分子克隆

                   基于前期转录组测序数据 (NCBI SRA           数据库，         1.6    HcNQO1  启动子序列的扩增
                           [18]
              PRJNA727624) ，筛选获得        HcNQO1  基因核心序              为获得三角帆蚌        HcNQO1  基因侧翼序列，本
              列片段。采用       cDNA  末端快速扩增 (RACE) 技术，             研究采用高效热不对称交错             PCR (hiTAIL-PCR) 技
              使用   LA Taq  酶进行全长    cDNA  克隆。首轮扩增参             术，以提取的肝胰腺基因组              DNA  为模板，使用
              数：94 ℃ 30 s，表    1  所示温度退火    30 s，72 ℃ 90 s，    Ex Taq  酶进行扩增。预扩增体系 (20 μL) 包含           Ex

              30  个循环。随后以稀释产物为模板，通过两轮嵌                         Taq  混 合 液  10 μL， LAD  引 物 、 Nq-pro-R1  引 物
              套  PCR  获得特异性扩增产物 。所得片段经纯化                       (10 mmol/L) 各  1 μL，基因组   DNA  约  40 ng，其余
                                        [19]
              后克隆至     pMD19-T  载体，转化大肠杆菌DH5α           感      体积用无菌水补足。第一轮             hiTAIL-PCR  体系 (25
              受态细胞，阳性克隆经生工生物工程 (上海) 股份                         μL) 包括  Ex Taq  混合液  12 μL，AC1  引物、Nq-pro-
              有限公司测序验证。                                        R2  引物 (10 mmol/L) 各  1 μL，以及预扩增产物稀
                                                               释液  1 μL (1∶40，体积比)。第二轮          hiTAIL-PCR
               1.4    生物信息学分析
                                                               体系 (50 μL) 包含  Ex Taq  混合液  25 μL，AC1  引物、
                   本研究利用      NCBI 开放阅读框 (ORF) Finder
                                                               Nq-pro-R3  引物 (10 mmol/L)各  1 μL，以及第一轮
              (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi/)  预 测
                                                               PCR  产物稀释液     1 μL (1∶10，体积比)。反应程序
              HcNQO1  基 因 的   ORF； 采 用   MAFFT  7.0  (https://           [20]
                                                               参照  Liu  等  的研究。扩增产物经琼脂糖凝胶电
              mafft.cbrc.jp/alignment/server/) 对  HcNQO1  推 导 的
                                                               泳分析后，目的片段回收并纯化。
              氨基酸序列与多个物种的同源序列进行比对。使
                                                                1.7    双荧光素酶报告基因实验与启动子突变
              用  MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) 网站分
                                                               分析
              析  HcNQO1  蛋白的保守基序 (motif)。采用           CDD
              数 据 库  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/   为研究    HcNrf2  对  HcNQO1  基因转录调控机
              wrpsb.cgi) 预 测 蛋 白 结 构 域 。 使 用        SOPMA      制，本研究构建了        HcNrf2 Neh1 结构域的过表达载
              (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?  体 (pcDNA3.1-Neh1)。将不同缺失长度的     HcNQO1
              page=npsa_sopma.html) 和  SWISS-MODEL  (https://  启动子序列克隆至        pGL3-Basic 荧光素酶报告载体，
              swissmodel.expasy.org/) 分别进行二级结构和三级              获得系列重组质粒        pGL3-HcNQO1 (P1 ~ P5)。
              结 构 预 测 。 利 用     ProtScale 工 具  (https://services.  将人胚胎肾      293FT  细胞培养于含     10%  胎牛血

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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