Page 60 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

闭壳肌中的表达水平相对适中，且无显著性差异； 共转染 293FT 细胞，以 pRL-TK 载体作为内参进
外套膜、斧足和肠道的 HcNQO1 表达量显著低于 行转染效率标准化。定量检测结果显示，与空载
血淋巴、鳃和闭壳肌 (P<0.05)，但外套膜、斧足 体对照组相比，pcDNA3.1-Neh1 共转染可显著提
和肠道之间的表达水平差异不显著 (图 5)。 升 P3 片段驱动的荧光素酶活性 (P<0.05)，而 P1
片段仅呈现出被抑制的转录活性 (图 7-a)。该结果

12
a
提示，位于−201 ~ −654 bp 区间的 P3 片段可能包
含 HcNrf2 的特异性调控元件。 P3 片段内
8
本实验基于生物信息学预测，在
相对表达量 relative expression 4 bc cd b 鉴定出 2 个具有差异结合评分的 ARE 元件：ARE1
bc
ARE2 (−476 ~ −463 bp)。通过
(−532 ~ −518 bp) 和
2
d d d 重 叠 PCR 技 术 构 建 出 3 种 突 变 型 报 告 质 粒 ：
及
NQO1-P3-
NQO1-P3-MUT1、 NQO1-P3-MUT2
0 MUT1+MUT2 (双位点突变)。
1 2 3 4 5 6 7 8
荧 光 素 酶 活 性 检 测 结 果 显 示 ， 单 突 变 组
组织
tissues (MUT1 和 MUT2) 的转录活性较野生型 P3 分别下
降约 10.4% 和 87.9% (P<0.05)。双突变组的活性虽
图 5 HcNQO1 mRNA 在不同组织中的表达
1. 血淋巴，2. 肝胰腺，3. 鳃，4. 外套膜，5. 斧足，6. 闭壳肌，7. 肠 较野生型下降约 59.3%，但仍显著高于空载体对
道，8. 性腺。不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)。下同。 照组 (P<0.05)。值得注意的是，MUT2 组的活性
Fig. 5 Distribution of the HcNQO1 mRNA in different 值与空载体无显著性差异 (P>0.05)。上述结果表
tissues 明，ARE1 和 ARE2 协同介导 HcNrf2 对 HcNQO1
1. hemolymph, 2. hepatopancreas, 3. gills, 4. mantle, 5. foot, 6. adductor, 的转录激活，双突变未完全消除激活效应 (图 7-b)。
7. intestines, 8. gonads. Different lowercase letters indicate significant
ARE2 在调控网络中起主导作用 (单突变 MUT2 即
differences between groups (P<0.05). The same below.
可使活性降至基线水平)。ARE1 可能具有辅助性
2.5 HcNQO1 启动子的扩增及基础活性
调控功能，其单独失活仍保留部分转录激活能力。
采 用 hiTAIL-PCR 技 术 从 三 角 帆 蚌 基 因 组 该发现揭示了 HcNrf2 通过差异结合 ARE 元件调
DNA 中扩增获得 HcNQO1 基因起始密码子 ATG 控下游抗氧化基因的分子机制，为解析贝类氧化
上游 1 109 bp 的启动子区域序列 (图 6-a，b)。序列分 应激响应通路提供了新的实验依据。
析显示，该启动子区包含 6 个 ARE 元件，经 JASPAR
2.7 HcNQO1 多克隆抗体的制备与检测
数据库预测为 HcNrf2 潜在结合位点 (图 6-a)。
为探究启动子本底的转录活性，本实验构建 通过原核表达系统在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中
成功诱导表达了重组蛋白 pET30a-NQO1。在 37 ℃
了 5 个长度递减的启动子缺失片段 (P1 ~ P5)，分
别克隆至 pGL3-Basic 荧光素酶报告载体 (图 6-c)。 条件下，采用 1 mmol/L IPTG 终浓度，以 220 r/min
振荡培养 4 h 进行蛋白诱导表达。SDS-PAGE 电
双荧光素酶检测显示，与 pcDNA3.1 (+) 共转染后，
泳分析显示，重组蛋白在菌体裂解后的沉淀和可
启动子片段 P2 (−488 ~ +26 bp) 和 P3 (−654 ~ +26
2+
bp) 的活性最高，而 P1 (−201 ~ +26 bp) 的活性最低。 溶性上清液中均有显著表达 (图 8-a)。通过 Ni 亲
和层析技术对可溶性组分进行纯化，获得分子量
全长的 P5 片段 (−1 109 ~ +26) 基础活性仅为对照
组的 1.57 倍，提示该启动子本底活性较低 (图 6-d)。 约 30.48 ku 的单一条带，与 pET30a-NQO1 蛋白的
理论分子量一致 (图 8-b)。
2.6 HcNrf2 调控 HcNQO1 启动子活性的分子
在上述条件下进行大规模蛋白表达后，将纯
机制研究
化蛋白免疫 4 ~ 6 周龄雌性 KM 小鼠制备多克隆抗
为评估 HcNrf2 过表达对 HcNQO1 启动子活 体。经过 3 次免疫程序，于末次免疫后第 7 天采
性的调控作用，本研究采用双荧光素酶报告基因 集小鼠血清。Western blot 检测证实抗体制备成功，
系统进行功能验证。实验将 5 个不同缺失长度的 实验采用 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 作为二抗进
启动子片段 (P1 ~ P5) 与 pcDNA3.1-Neh1 表达载体 行显色反应。进一步应用该多克隆抗体检测三角

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