Page 71 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

第 56 卷第 5 期 栾亚萁，等：医用臭氧对脓毒症肾损伤的治疗作用及其机制 603

国 Moor 公司）；凝胶电泳仪、转膜槽、分子成像仪 进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在
ChemiDoc 系统（美国 Bio-Rad 公司）；C5 酶标仪（美 400 倍显微镜下随机选取 5 个视野拍照，并用双盲
国赛默飞世尔科技公司）；LSM800免疫荧光双光子 法量化近端肾小管损伤程度。
共聚焦显微镜（德国 Carl Zeiss公司）；纳米颗粒跟踪 2.4 下肢血流测量
分析仪（德国 Particle Metrix公司）。 小鼠麻醉后，以激光散斑多普勒血流仪扫描下
1.3 动 物 肢血流。扫描头距离暴露的小鼠下肢 20 cm 进行
C57BL/6J 小鼠（20~25 g，SPF 级）购自南京医 扫描，下肢血流灌注水平由监视器采集。
科大学医药实验动物中心，许可证号：SCXK（苏） 2.5 肾组织免疫荧光检测
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2021-0001。C57BL/6J 背景的 Sr-a1 小鼠由南京医 固定的肾组织切片用二甲苯脱蜡，再水合，并
科大学陈琪教授馈赠。所有动物实验均经南京医 封闭。切片分别与抗 Cit-H3、TF、KIM-1、F4/80 的
®
科大学动物爱护与使用委员会批准（编号：IACUC- 一抗或 CoraLite 488 TUNEL 染料孵育。洗涤切片
2305042），最大限度减少动物痛苦和使用数量。所 并用荧光标记的二抗染色。细胞核用 DAPI 复染。
有操作均按照《实验动物管理和使用指南》规范 2.6 Western blot 蛋白印迹检测
进行。 将肾组织切块在 RIPA 裂解缓冲液中匀浆并
用 BCA 分析试剂盒测量蛋白质浓度。用 SDS-
2 方 法
PAGE 凝胶分离等量的蛋白质（每孔 40 μg），随后转
2.1 动物造模与取材 移到 PVDF 膜。室温下用 10% TBST 全脂牛奶封
小鼠在（22±2） ℃、12 h/12 h 明暗交替条件下 闭膜 2 h，分别加入抗 Cit-H3 抗体、组蛋白 H3 抗
适应性饲养 2 d，自由摄食饮水，实验全程维持标准 体、TF 抗体、TFPI 抗体、MMP9 抗体、NE 抗体、IL-

SPF 环 境 。 药 效 试 验 将 C57BL/6J 小 鼠 随 机 分 1β 抗体、PAR-2 抗体、p53 抗体、Bax 抗体、KIM-1
4 组，每组 6 只，分别为对照组、模型组（LPS）、治疗组（LPS + 抗体、TNF-α 抗体、p-AMPK 抗体、AMPK 抗体、
臭氧）和单给臭氧组。LPS（12.5 mg/kg）用生理盐水 Albumin 抗体或 β-actin 抗体，在 4 ℃ 下孵育过夜。
溶 解 后 予 小 鼠 腹 腔 注 射 造 模 。 治 疗 组 小 鼠 在 随后加入辣根过氧化物酶偶联的相应二抗，室温孵
LPS 注射之前 2 小时腹腔注射臭氧（15 μg/mL，0.5 mL）。 育 1 h。用分子成像仪获取数据，并用 ImageJ 定量
单给臭氧组小鼠的给药量和给药时间同治疗组。 分析。
机制实验将 C57BL/6J 小鼠和 Sr-a1 小鼠分别随机 2.7 NETs 相关指标的检测
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分 3 组，每组 6 只，各分为对照组、模型组（LPS）、 用 ELISA 检测试剂盒检测血浆样本中 Cit-H3
治疗组（LPS +臭氧）。造模方法和臭氧剂量同上。 和 MPO-DNA 的水平。
LPS 注射 24 h 后对所有组别小鼠麻醉，分别于小鼠 2.8 骨 髓 源 性 巨 噬 细 胞 （ bone marrow-derived
眶下区域取血，抗凝管收集，离心得到血浆。取血 macrophage，BMDM）细胞培养
后的小鼠实施安乐死，摘取部分肾脏组织投入 从健康 C57BL/6J 小鼠的股骨和胫骨中分离骨
4% 多聚甲醛中进行固定，并将所有剩下的组织迅 髓细胞，并在 DMEM 培养基中加入 10% L929 细胞
速投入液氮中，转移至−80 ℃ 超低温冰箱以备后续 提取物共培养 7 d，以分化为 BMDMs 。对诱导成
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分析。TF-MPs 提取和鉴定实验将 C57BL/6J 小鼠 功 的 BMDM 按 照 以 下 分 组 处 理 ： 正 常 对 照 组 ，
随机分 4 组，每组 4 只，分别于 LPS（12.5 mg/kg）注 LPS 刺激组（100 ng/mL）、LPS+臭氧组、单给臭氧
射后 0，6，12，24 h 麻醉取血，离心后收取 MPs 。 组。臭氧（15 μg/mL）在 LPS 刺激前 4 h 缓慢注入等
[11]
2.2 肾功能检测 体积细胞培养上清液。
使用肌酐检测试剂盒（肌氨酸氧化酶法）和尿 2.9 血浆 MPs 的检测分析
素氮检测试剂盒（脲酶法）测定小鼠血液样品中的 分离 LPS 模型小鼠血浆中的 MPs 。以纳米
[11]
CR 和 BUN 含量。 粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）
2.3 肾组织病理检测 方法检测其粒径和浓度。将富含 MPs 的血浆离心
肾组织用多聚甲醛溶液固定后，做石蜡切片， 沉淀物用 PBS 稀释至终体积 1 mL。通过纳米颗粒