Page 62 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

594 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 592 − 600 第 56 卷

0003。细胞为 C57BL/6 小鼠提取的原代肺成纤维 2.5 蛋白免疫印迹
细胞。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准， 将第 3 代肺原代成纤维细胞以每毫升 2.5×
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并获得伦理审批（审批编号：A2023219-009）。 10 个的密度接种到 6 孔板中，并在 37℃、5% CO 2
的细胞培养箱中过夜培养。当细胞汇合度达 60%~
2 方 法
70% 时，用药物处理细胞：对照组用等体积的 DMSO
2.1 肺原代成纤维细胞提取与培养 处理，模型组用博来霉素（0.5 μg/mL）处理，实验组
以颈椎脱臼法处死 C57BL/6 小鼠，取出小鼠的 博来霉素（0.5 μg/mL）和豆蔻明（10 μmol/L）共处理，
全部肺组织（左肺 1 叶，右肺 4 叶）放入预冷的 回复实验组用博来霉素（0.5 μg/mL），豆蔻明（10
DMEM 培养基中并置于冰上保存。用 DMEM 培 μmol/L）和 MHY1485（5 μmol/L）共同处理。各组细
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养基配制 1 mg/mL 的胶原酶Ⅳ型溶液共 2 mL。将 胞放入 37℃、5% CO 的培养箱中培养 24 h。24
h 后用 1×上样缓冲液收集样品，99℃，10 min 金属
肺组织转移到胶原酶溶液中，用剪刀将肺组织尽量
浴热变性样品。用 10% SDS-PAGE 分离胶电泳分
剪碎，然后放入 37℃ 培养箱消化 30 min。消化结
离蛋白质（浓缩胶 80 V，30 min，分离胶 120 V，90
束后，向其中加入 6 mL DMEM 培养基，1 700 r/min
min）,通过湿转法（110 V，90 min）将蛋白转移到
离心 5 min。弃上清液，再加入 DMEM 5 mL 培养
0.45 μmol/L 硝 化 纤 维 素 膜 上 。 转 膜 结 束 后 用
基重悬，1 700 r/min 离心 5 min 收集细胞，重复该步
5% 的脱脂牛奶室温封闭 1 h，再分别孵育一抗：
骤。用含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的
p21（1∶200）、p53（1∶1 000）、胶原蛋白（1∶1 000）、α-
完全 DMEM 培养基重悬小鼠肺组织并接种到 10
SMA（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）
cm 培养皿中，放置在 37℃、5% CO 的培养箱中培
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和 β-actin（ 1∶1 000） ， 4℃ 过 夜 。 回 收 一 抗 ， 并 用
养。每 48 小时更换一次完全培养基，当细胞汇合
HRP 标记二抗（1∶5 000）孵育 2 h，最后用化学发光
度达 80% 时进行常规传代培养。
成像仪（Bio-Rad）采集图像。Image J 软件进行灰度
2.2 衰老相关 β-半乳糖苷酶检测
分析。
将 第 3 代 肺 原 代 成 纤 维 细 胞 以 每 毫 升 1×
2.6 数据统计
10 个的密度接种到提前放入爬片的 24 孔板中，并
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使用 GraphPad Prism 软件进行数据处理，结果
在 37℃、5% CO 的细胞培养箱中过夜培养。当细
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以均值±标准误（ x± s）表示。差异性分析采用单因
胞汇合度达 40%~50% 时，用药物处理细胞：对照组
素方差分析并配合 Tukey 检验，其中 P<0.05 表示
用等体积的 DMSO 处理，模型组用 H O （50 μmol/L）
2 2 差异具有统计学意义。
或博来霉素（0.5 μg/mL）处理，实验组用 H O （50
2
2
μmol/L）或博来霉素（0.5 μg/mL）处理的同时共处理 3 结 果
梯度浓度的豆蔻明（1，5，10 μmol/L），回复实验组用
3.1 豆蔻明缓解博来霉素诱导的肺成纤维细胞衰老
博 来 霉 素 （ 0.5 μg/mL） ， 豆 蔻 明 （ 10 μmol/L） 和
博来霉素是一种 DNA 损伤剂，能通过诱导
MHY1485（5 μmol/L）共同处理。各组细胞放入
DNA 双链断裂激活 ATM/ATR-p53 介导的 DNA 损
37℃、5% CO 的培养箱中培养 24 h。按照试剂说
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伤反应通路，诱导衰老 [7−8] 。为了研究豆蔻明是否能
明书用衰老相关 β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测，并
够缓解博来霉素诱导的细胞衰老，使用博来霉素
用正倒置一体荧光显微镜观察拍照。 （0.5 μg/mL）处理原代肺成纤维细胞诱导细胞衰老
2.3 DNA 损伤检测 模型，同时加入梯度浓度的豆蔻明（1，5，10 μmol/L）
细胞处理步骤同“2.2”项。按照试剂说明书用 处理细胞。SA-β-gal 活性的检测表明，与对照组相
DNA 损伤检测试剂盒检测，并用全光谱激发共聚焦 比，博来霉素处理组衰老细胞阳性率显著升高，而
显微镜观察拍照。 在豆蔻明处理后显著抑制了博来霉素的诱导作用，
2.4 ROS 检测 并呈现剂量依赖（图 1-A，图 1-B）。为了进一步验
细胞处理步骤“2.2”项。按照试剂说明书用 证豆蔻明对细胞衰老的缓解作用，又通过免疫荧光
ROS 试剂盒检测，孵育 DCFH-DA 探针的同时孵育 检测了 DNA 损伤标志物，同样也是衰老标志物的
Hoechst，用正倒置一体荧光显微镜观察拍照。 γ-H2AX。实验结果显示博来霉素处理组的 DNA