Page 146 - 《渔业研究》2025年第5期
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第 5 期 魏 华等： 基于超分支滚环扩增技术对中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的高灵敏检测 687
a) M 1 2 3 4 5 6 b) M 1 2 3 4 5 6
长度/bp 长度/bp
Length Length
500
500
400 400
300 300
200 200
150 150
100 100
50
50
c) M 1 2 3 4 5 6 7 d) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
长度/bp 长度/bp
Length Length
500
400
300 500
200 400
300
150 200
100 150
50 100
50
图 5 HRCA 检测体系的优化
Fig. 5 Optimization of HRCA detection system
注：a. HRCA 技术 PLP 浓度优化（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：100 μmol/L； 泳道 2：10 μmol/L；泳道 3：1 μmol/L；
泳道 4：0.1 μmol/L；泳道 5：0.01 μmol/L；泳道 6：阴性） 。b. HRCA 技术扩增温度优化（M：DL 500 DNA Marker；泳道
1：63 ℃；泳道 2：60 ℃；泳道 3：57 ℃；泳道 4：54 ℃；泳道 5：51 ℃；泳道 6：阴性） 。c. HRCA 技术扩增时间优化
（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：60 min； 泳道 2：50 min；泳道 3：40 min；泳道 4：30 min；泳道 5：20 min；泳道 6：
10 min；泳道 7：阴性） 。d. Bst DNA 聚合酶大片段浓度优化（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：1 U/mL；泳道 2：2 U/mL；
泳道 3：3 U/mL；泳道 4：4 U/mL；泳道 5：5 U/mL；泳道 6：6 U/mL；泳道 7：7 U/mL；泳道 8：8 U/mL；泳道 9：阴性） 。
Notes: a. Optimization of HRCA PLP concentrationn (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: 100 μmol/L; Lane 2: 10 μmol/L; Lane
3: 1 μmol/L; Lane 4: 0.1 μmol/L; Lane 5: 0.01 μmol/L; Lane 6: Negative). b. Optimization of HRCA amplification temperature (M: DL
500 DNA Marker; Lane 1: 63 ℃; Lane 2: 60 ℃; Lane 3: 57 ℃; Lane 4: 54 ℃; Lane 5: 51 ℃; Lane 6: Negative) . c. Optimization of
HRCA amplification time (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: 60 min; Lane 2: 50 min; Lane 3: 40 min; Lane 4: 30 min; Lane 5: 20 min;
Lane 6: 10 min; Lane 7: Negative). d. Optimization of Bst DNA polymerase concentration(M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: 1 U/mL;
Lane 2: 2 U/mL; Lane 3: 3 U/mL; Lane 4: 4 U/mL; Lane 5: 5 U/mL; Lane 6: 6 U/mL; Lane 7: 7 U/mL; Lane 8: 8 U/mL; Lane 9:
Negative).
2.2.3 扩增温度的优化 明显扩增条带；从 20 min 开始，图 5c 泳道 5 显
如图 5b 所示，当扩增温度为 51 ℃ 时，未有 示，HRCA 成功扩增出明亮条带；当扩增时间延长
扩增条带；当扩增温度为 54 ℃ 时，电泳条带亮度 至 30、40、50 和 60 min 时，扩增产物均无显著增
开始逐渐增加；当扩增温度为 57~60 ℃ 时，电泳 加。因此，为保证扩增效率，同时尽可能减少检测
图中扩增产物的条带亮度无显著差异；当扩增温 时间，最终扩增时间设置为 20 min。
度达到 63 ℃ 时，条带亮度明显增强。因此，认为 2.2.5 Bst DNA 聚合酶浓度的优化
63 ℃ 为最佳扩增温度。 如图 5d 所示，随着 Bst DNA 聚合酶浓度的增
2.2.4 扩增时间的优化 加，HRCA 反应条带的亮度也逐渐增强，当 Bst
如图 5c 所示，当扩增时间为 10 min 时，未见 DNA 聚合酶浓度为 1 U/mL 时，可见条带亮度微
