Page 143 - 《渔业研究》2025年第5期

684 渔 业 研 究 第 47 卷

设 置 HRCA 反 应 温 度 分 别 为 51、 54、 57、 60、 橄榄假丝酵母菌（Candid oleophila） ；细菌类 2 种，
63 ℃；设置反应时间分别为 10、20、30、40、50、 即溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus） 、恶臭假单胞菌
60 min；设置 Bst DNA 聚合酶浓度分别为 1、2、 （Pseudomonas putida） ；寄生虫类 2 种，即血卵涡
3、4、5、6、7、8 U/mL。其他条件按照所建立的 鞭虫（Hematodinium sp.） 、微孢子虫（Hepatospor

HRCA 体系进行试验，以确定最佳浓度。 eriocheir） ；病毒类 2 种，即草鱼呼肠孤病毒（Grass
1.3.5 HRCA 灵敏度分析 carp hemorrhagic virus，GCHV）和鲤疱疹病毒 3 型
根据预试验结果，将二尖梅奇酵母标准 DNA （Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3） 。以上物种的核
稀释成 12 个浓度梯度，分别为 1 000、500、250、 酸序列如表 2 所示。所有核酸链稀释后，分别以
100、10、5.0、2.5、1.0、0.75、0.50、0.25、0.10、 1 000 fmol/L 的浓度与 PLP 进行 HRCA 反应；二尖
0 fmol/L，其中 0 fmol/L 作为对照。以优化后的 梅奇酵母靶核酸 DNA 单链以 10 fmol/L 浓度与 PLP
HRCA 体系进行扩增。 特异性结合。为评估 PLP 在单碱基错配识别方面的
1.3.6 HRCA 特异性分析 能力，本研究设计并合成 3 条非靶标寡核苷酸链，对
通过 NCBI 查找并比对与二尖梅奇酵母同属不 照检测靶标分别设计 1 个、2 个和 3 个碱基错配，具
同种、同科不同属以及不同科与属的共 11 个物种， 体核酸序列见表 3。利用 1 μmol/L 二尖梅奇酵母靶标
包括酵母类 5 种，即 M. australia、佐贝尔梅奇酵 ssDNA 作为阳性对照，与错配 1 个碱基的 S1、错配
母（M. zobellii） 、M. agaveae、Clavispora opuntiae、 2 个碱基的 S2 以及错配 3 个碱基的 S3 进行扩增比较。

表 2 用于 HRCA 种属间特异性分析的核酸序列
Tab. 2 Nucleic acid sequences for interspecies specificity analysis of HRCA
名称 序列（5’—3’ ） 碱基数/nt GenBank 登录号
Name Sequences (5’—3’) Base number GenBank accession numbers
M. australia AGGTGGCCTCAGTTAGTCCAAACATTCTTAAGTCCAT 37 U44824
佐贝尔梅奇酵母
M. zobellii AGGTGGTCTCAGTTAGATTAAAACATGCTTAAGTCCA 37 U44823
M. agaveae AGGTTGAGAGGTTTGGCACCACGCATCTCTAAGTCCA 37 U84243
C. opuniae AGGAGCAGGGTCTTTGTGTTGTACGCGCCCAAGTCCA 37 U44818
橄榄假丝酵母菌 AGAAGGTAACTTTGGAATTGGCTCTTGTCTATGTTCC 37 KJ624036.1
C. oleophila
溶藻弧菌
V. alginolyticus AGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCT 37 NR044825.2
恶臭假单胞菌
P. putida AGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCT 37 AJ310536.1
血卵涡鞭虫
Hematodinium sp. AGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCGC 37 ON324184.1
微孢子虫
H. eriocheir AGGTACCATGCGGTACAGGAAGGAGAAGGCTATAACA 37 HE584635.1
草鱼呼肠孤病毒
GCHV AGGTATCGGGTAACGGAGCCGAGCTGTTTCGCGTGAG 37 AF284504.1
鲤疱疹病毒 3 型
CyHV-3 AGGCACTTCAGAAAACTCAGACCCAGAAAACGGATCC 37 KP004901.1

表 3 HRCA 靶标与错配碱基寡核酸序列
Tab. 3 HRCA target and mismatched base oligonucleotide sequences
名称 序列（5’—3’ ） 碱基数/nt
Name Sequences (5’—3’) Base number
靶标 Splint AGGTGGTCTCAGTTAGTTCAAACATTCTTAAGTCCAT 37
S1 AGGTGGTCTCAGTTAGTTTAAACATTCTTAAGTCCAT 37
S2 AGGTGGTCTCAGTTAGTTTCAACATTCTTAAGTCCAT 37
S3 AGGTGGTCTCAGTTAGTTTCCACATTCTTAAGTCCAT 37
注：横线部分为突变碱基；加粗部分为靶标序列与 PLP 互补配对区域。
Notes: The underlined parts are mutated bases, and the bold parts are the complementary pairing regions between the target sequence and PLP.