Page 144 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 魏 华等： 基于超分支滚环扩增技术对中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的高灵敏检测 685

1.3.7 HRCA 重复性及稳定性分析 1.3.9 qPCR 对实际样本的检测
以相同浓度的二尖梅奇酵母靶标 ssDNA 作为 为了验证 HRCA 技术的实用性及可靠性，采
模板，由 3 名不同试验人员进行 HRCA 检测，通 用 qPCR 技术进行平行检测，比较 2 种方法的阳性
过琼脂糖凝胶电泳结果评估该检测方法的重复性。 检出率。根据二尖梅奇酵母 26S rRNA 基因序列
将 HRCA 产物在 4 ℃ 下分别放置 24、48 和 72 h （U44822） ，使用 Primer Premier 5 软件设计特异
后，用 2 % 的琼脂糖凝胶进行电泳分析，以此判断 性引物，引物序列见表 4。将中华绒螯蟹肝胰腺
扩增产物的稳定性。 DNA 样本进行 10 倍梯度稀释，再将各稀释度样本
1.3.8 HRCA 对实际样本的检测 进行 qPCR 扩增。具体反应体系为 10.0 μL 2× Taq
随机选取 80 个中华绒螯蟹肝胰腺组织 DNA， Master Mix、 10 μmol /L 上 下 游 引 物 各 0.4 μL、
经由 aPCR 产生的 ssDNA 作为扩增的靶标模板， 2.0 μL DNA 模板，用无菌水补充至 20.0 μL。反应
用优化后的反应体系进行 HRCA，以评估实际样本 程序为 95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃
的检测效率。同时，通过 10 倍梯度稀释提取的中 30 s，40 个循环。最终通过监测荧光信号，基于循
华绒螯蟹肝胰腺 DNA 样本，评定该方法对实际样 环阈值（Cycle threshold，Ct）值绘制标准曲线并
本的检测灵敏度。 计算扩增效率。

表 4 qPCR 引物序列
Tab. 4 qPCR primer sequence
名称 序列（5’—3’ ） 碱基数/nt
Name Sequences (5’—3’) Base numbers
上游引物 A1 Forward primer A1 AAGGTGGTCTCAGTTAGTTC 20
下游引物 A1 Reverse primer A1 TGTTCGCTATCGGTCTCT 18
注：aPCR 序列同 qPCR。
Note: aPCR sequence is the same as qPCR.

1.4 数据处理 结果（图 3a）显示，只有病蟹 DNA 样本扩增出明
本研究中所有组别均设置 3 个平行，以平均 亮条带，与目的片段一致，大小为 195 bp；而健康
值±标准差（Mean ± SD）表示。所有试验数据用 蟹未扩增出目的条带。对扩增条带进行胶回收、检
IBM SPSS Statisitcs 27 进行处理与汇总；用 Origin 测，并分别与 GenBank 上登录的同属 26S rRNA 序
2024 进行曲线拟合及图形绘制。 列（U44822）进行同源性比较，测序结果显示与
二尖梅奇酵母的同源性达到 99 %（图 3b） 。
2 结果与分析
2.2 HRCA 检测体系的建立及优化
2.1 病蟹典型症状及 PCR 鉴定 2.2.1 HRCA 检测体系的建立
在中华绒螯蟹感染二尖梅奇酵母后，可观察到 本研究验证了 HRCA 体系的可行性，结果如
病蟹活力明显减弱、不进食、行动迟缓、肌肉不透 图 4 所示。体系在单一未添加 PLP、T4 DNA 连接
明或发白、血淋巴呈现乳白色，最终因器官衰竭而 酶、DNA 模板和 Bst DNA 聚合酶的情况下，均无
死亡。对病蟹（图 2a）与健康蟹（图 2b）进行比 条带产生。只有在上述主要反应物都存在时，且
在 T4 DNA 连接酶的催化作用、PLP 与 DNA 模板
较，可见患病导致蟹盖内蓄积大量白色乳状液体。
进行环化、后续 Bst DNA 聚合酶发生高效的催化反
对中华绒螯蟹 DNA 样本进行 PCR 检测，电泳
应条件下，体系才能够进行 HRCA，如图 泳道
4 1
a) b)
所示。结果进一步证明了 HRCA 的扩增模板是环
化的 PLP，或环化的 PLP 是 HRCA 的引物模板。
2.2.2 PLP 浓度的优化
如图 5a 所示，当 PLP 浓度为 100、10 和 1 μmol/L
时，均能够观察到清晰的梯状 DNA 条带；当 PLP
浓度为 0.1 μmol/L 时，条带的亮度明显减弱；当 PLP
图 2 病蟹（a）与健康蟹（b） 浓度为 0.01 μmol/L 时，已无扩增条带出现，与对
Fig. 2 Diseased (a) and healthy (b) E. sinensis 照组无差异。因此，后续试验采用 1 μmol/L PLP。