Page 142 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 魏 华等： 基于超分支滚环扩增技术对中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的高灵敏检测 683

用下，PLP 与 ssDNA 进行特异性连接，利用核酸 后的产物作为模板，在 Bst DNA 聚合酶作用下发
外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ切割未连接片段。以环化 生 HRCA 反应。

表 1 HRCA 锁式探针与引物序列
Tab. 1 HRCA PLP and primer sequence
名称 序列（5’—3’ ） 碱基数/nt
Name Sequences (5’—3’) Bases number
p-AACTAACTGAGACCACtggactgctgaatccgttagccagcagccgcctccttatta
HRCA 锁式探针 ::::::::::::::::: 97
HRCA PLP tcacttattcaggcgtagcaccagGACTTAAGAATGTTTG
:::::::::::::::::::
HRCA 引物 1
HRCA primer 1 GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG 24
HRCA 引物 2
HRCA primer 2 CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA 21
注：HRCA 锁式探针中大写字母表示与检测靶标的结合区，波浪线部分表示引物结合位点。
Notes: The capital letters in the HRCA PLP are the binding regions to the assay target, and the wavy line portions are the primer binding sites.

二尖梅奇酵母
M. bieuspidate

F aPCR Ⅰ
Ⅲ
R
E. sinensis
中华绒螯蟹 Primer1 Primer2
Hepatopancreas
肝胰腺
双链 DNA 单链 DNA 上游引物 R 下游引物
ds DNA ssDNA F Forward primer Reverse primer
核酸外切酶Ⅰ
锁式探针 目的片段 T4 DNA 连接酶 Ⅰ ExonucleaseⅠ
PLP Detection terminal T4 DNA ligase 核酸外切酶Ⅲ
Bst DNA 聚合酶 引物1 引物2 Ⅲ Exonuclease Ⅲ
多余碱基
Bst DNA polymerase Primer 1 Primer 2
Redundant bases
图 1 HRCA 扩增原理图
Fig. 1 Schematic diagram of HRCA amplification

1.3.2 PCR 产物分析 的体系并进行改进，分为连接反应、酶切反应和
为确定采集的中华绒螯蟹是否感染二尖梅奇酵 HRCA 反应 3 个部分。连接反应体系 10.0 μL：内
母，对提取的 DNA 进行 PCR 鉴定。PCR 技术所 含靶标 DNA 1.0 μL、1 μmol/L HRCA PLP 1.0 μL、
用引物和程序同 qPCR，对 PCR 产物进行琼脂糖凝 10×T4 DNA 连接酶缓冲液 1.0 μL、175 U/μL T4
胶电泳，切胶回收目的片段并进行测序，电泳条件 DNA 连接酶 0.5 μL 和无菌水 6.5 μL。连接反应体
为琼脂糖浓度 2 %、电压 120 V、电泳 20 min。本 系在 37 ℃ 反应 10 min，72 ℃ 孵育 10.0 min。在

研究按照诺唯赞凝胶回收试剂盒（FastPure Gel 上述连接产物中，加入 2.5 U/μL 核酸外切酶Ⅰ，
DNA Extraction Mini Kit）的操作步骤进行切胶回 100 U/μL 核酸外切酶Ⅲ进行酶切，37 ℃ 30 min，
收，后续送至生物公司进行测序。 90 ℃ 20 min。上述酶切产物加入 2 U/mL Bst DNA
1.3.3 HRCA 反应锁式探针和引物设计 聚合酶、10×Bst DNA 聚核酶缓冲液、10 μmol/L
基 于 二 尖 梅 奇 酵 母 26S rRNA 的 基 因 序 列 脱氧核苷三磷酸（Deoxynucleotide triphosphates，
（U44822）设计 PLP，其中的连接序列参考孔铖 dNTPs） 、10 μmol/L 引物 1 和 10 μmol/L 引物 2，
将等 [25] 的设计。扩增引物和高特异性、强稳定性 再用无菌水补齐至 25 μL，63℃ 孵育 20 min，进
探针序列由 Primer Premier 5 设计，并在 NCBI 数 行 HRCA 反应。之后进行 2 % 琼脂糖凝胶电泳，
据库进行比对，利用软件 RNA Structure 5.3 预测探 并对电泳结果图进行拍照记录。
针结构，避免产生二级结构。 对 HRCA 主要的影响因素 PLP 浓度、扩增温
1.3.4 HRCA 检测体系的建立及优化 度、扩增时间和 Bst DNA 聚合酶浓度进行优化。设
本研究所用的 HRCA 检测体系参照蔡盼盼 [26] 置 PLP 浓度分别为 100、10、1、0.1 和 0.01 μmol/L；