Page 141 - 《渔业研究》2025年第5期

682 渔 业 研 究 第 47 卷

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螯蟹养殖区暴发“牛奶病”，死亡率超过 30% ， 病毒等检测，如地毯草黄单胞杆菌（Xanthomonas
对中华绒螯蟹养殖产业造成巨大的经济损失，严重 axonopodis pv. citri，Xac） [18] 、沙门氏菌（Salmo-
阻碍了其产业的可持续发展。 nella） [19] 、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2 型
“牛奶病”因感染蟹类的血淋巴呈乳白色而得 （ Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，
名，又称“乳化病”。患病蟹类表现出关节肿胀和 SARS-CoV-2）等病原体 [20] 以及海洋卡盾藻（Cha-
肌肉白浊，同时蟹类活力下降，附肢易脱落，最终 ttonella marina） [21] 等；而用于水产病原的检测，
死亡。Bao 等 [4] 研究发现，中华绒螯蟹“牛奶病” 仅见于检测虹彩病毒 [22] 、传染性皮下和造血病
的病原是二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspi- 毒 [23] 和黄头病毒 [24] 。
date） 。二尖梅奇酵母是一种条件性致病菌，广泛 为建立基于二尖梅奇酵母的特异且高灵敏的
存在于淡水和海洋环境中，可感染多种具有重要经 HRCA 体系，本文以中华绒螯蟹“牛奶病”病原——
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济价值的水生动物，包括中华绒螯蟹 、大马哈鱼 二尖梅奇酵母为研究对象，筛选二尖梅奇酵母 26S
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（Oncorhynchus tshawytscha） 、脊尾白虾（Exo- rRNA 基因（U44822） ，通过序列比对选取特异性
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palaemon carinicauda） 、中华小长臂虾（Palae- 靶核酸序列，设计锁式探针（Padlock probe，PLP）
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monetes sinensis） 、三疣梭子蟹（Portunus tritu- 和引物，并评价该技术的灵敏度、特异性、重复
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berculatus） 、大型蚤（Daphnia magna） 、卤 性；最后对实际样本进行检测，对比验证该技术的
虫（Artemia salina） [9] 和罗氏沼虾（Macrobrac- 检出率。本研究旨在为中华绒螯蟹“牛奶病”的池
hium rosenbergii） [10] 等，因而其严重威胁着渔业 边检测和防控提供技术支持。
经济的健康发展。
目前，中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵 1 材料与方法
母常规的检测方法以聚合酶链式反应（Polymerase 1.1 试验材料
chain reaction，PCR）为主 [4, 11] ，但常规 PCR 技术
中华绒螯蟹 [（7.8±0.7）g]100 只，其中 30 只
存在灵敏度和特异性不足等问题，对感染初期的病
采自江苏省盐城市，70 只采自辽宁省盘锦地区发
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蟹不能准确诊断。针对这些问题，Bao 等 建立
病蟹塘。使用 DNA 提取试剂盒提取全部中华绒螯
了巢式 PCR 检测技术，灵敏度和特异性均得到提
蟹肝胰腺 DNA，−20 ℃ 保存备用。本研究经沈阳
升，但该方法耗时长，易出现假阳性，且不能实现 农业大学动物科学与医学学院伦理委员会审批，编
定量检测；Xing 等 [13] 建立了实时荧光定量 PCR
号为 24022102。
（Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）检
1.2 试验试剂
测二尖梅奇酵母的方法，具有灵敏度高、特异性强
本研究所用寡核苷酸由生工生物工程（上海）
和重复性好的优势，且可以定量检测，但是其依赖
股份有限公司合成，具体序列见表 1。Bst DNA 聚
于昂贵的检测设备，也不适于池边检测。
合酶购自 NEB（美国）有限公司。T4 DNA 连接
滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）
技术是一种高效的等温核酸扩增技术，于 20 世纪 酶、dNTP、2×Taq Master Mix、DNA Ladder 500
90 年代中期被开发并应用于分子生物学研究 [11] 。 Marker 购自 TaKaRa（大连）生物技术有限公司。
Lizardi 等 [14] 首次将 RCA 技术引入到基因的突变 SYBR qPCR Master Mix 和 PCR 产物回收试剂盒均
检测中，提出了基于单一引物的线性滚环扩增 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。海洋动物组织
（Linear RCA，LRCA）技术和基于双引物的超分 基因组 DNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有
支 滚 环 扩 增 （ Hyper-branched RCA， HRCA） 技 限公司。DNA Good View TM 核酸染料购于北京赛
术。LRCA 技术因操作简便，而受到人们的关注， 百盛基因技术有限公司。琼脂糖购自上海贝晶生物
但是由于其灵敏度具有局限性，因此人们把关注度 技术有限公司。
转向具有更高检测灵敏度的 HRCA 技术。HRCA 1.3 试验方法
技术引入两条引物，能够实现对靶标的指数型扩 1.3.1 HRCA 反应原理步骤
增，从而获得更高的检测灵敏度。目前，HRCA 技 HRCA 技术扩增如图 1 所示，提取中华绒螯蟹
术已被广泛应用在细胞 [15] 、脱氧核糖核酸（Deoxyri- 肝胰腺 DNA，经由不对称 PCR（Asymmetric PCR，
bonucleic acid，DNA） [16] 、核糖核酸（Ribonucleic aPCR）扩增获得单链 DNA（Single-stranded DNA，
acid，RNA） [17] 和小分子检测中，多见于细菌、 ssDNA） 。以此作为靶标，在 T4 DNA 连接酶的作