Page 147 - 《渔业研究》2025年第5期

688 渔 业 研 究 第 47 卷

弱；当 Bst DNA 聚合酶浓度升高至 2 U/mL 时，有 带 产 生 。 为 提 高 检 测 的 灵 敏 度 ， 本 研 究 对 0~
明亮扩增条带，可引发扩增；当 Bst DNA 聚合酶 1 fmol/L 的靶标进行精细化检测，设置浓度分别
浓度在 3~8 U/mL 时，与 2 U/mL 时的比较，条带 为 1.0、0.75、0.50、0.25 和 0.10 fmol/L，结果如
亮度未出现明显差异。因此，选取 2 U/mL 作为 图 6b 所示。当靶标浓度为 1.0~0.50 fmol/L 时，可

HRCA 反应中 Bst DNA 聚合酶的最终浓度。 见清晰产物条带；当靶标浓度降至 0.25 fmol/L
2.3 HRCA 技术的灵敏度 时，条带很微弱；当靶标浓度为 0.10 fmol/L 时，
从图 6a 可见，通过 HRCA，靶标 DNA 浓度 靶标已经没有扩增，与对照组一致。因此，为使检
为 1 000 fmol/L 至 1 fmol/L 的样本（泳道 1~泳道 9） 测结果具有清晰可见性，该检测方法的检测限是
均有明亮产物条带，而 0.1 fmol/L 样本无明亮条 0.50 fmol/L。

a) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 b) M 1 2 3 4 5 6
长度/bp 长度/bp
Length Length
500
400
300 500
400
200 300
150 200
100 150
100
50 50

图 6 HRCA 技术的灵敏度
Fig. 6 Sensitivity of HRCA
注：a. HRCA 技术灵敏度检测（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：阴性；泳道 2：1 000 fmol/L；泳道 3：500 fmol/L；
泳道 4： 250 fmol/L；泳道 5：100 fmol/L；泳道 6：10 fmol/L ；泳道 7： 5 fmol/L；泳道 8： 2.5 fmol/L；泳道 9：1 fmol/L；
泳道 10：0.1 fmol/L ） 。b. HRCA 技术灵敏度检测 0.10~1.0 fmol/L（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：1.0 fmol/L；泳道 2：
0.75 fmol/L；泳道 3： 0.50 fmol/L；泳道 4：0.25 fmol/L；泳道 5：0.10 fmol/L；泳道 6：阴性） 。
Notes: a. HRCA sensitivity detection (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: Negative; Lane 2: 1000 fmol/L; Lane 3: 500 fmol/L;
Lane 4: 250 fmol/L; Lane 5: 100 fmol/L; Lane 6: 10 fmol/L; Lane 7: 5 fmol/L; Lane 8: 2.5 fmol/L; Lane 9: 1 fmol/L; Lane 10:
0.1 fmol/L). b. HRCA sensitivity detection (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: 1.0 fmol/L; Lane 2: 0.75 fmol/L; Lane 3: 0.50 fmol/L;
Lane 4: 0.25 fmol/L; Lane 5: 0.10 fmol/L; Lane 6: Negative).

2.4 HRCA 技术的特异性 果如图 8b 显示，24、48 和 72 h HRCA 产物的扩
2.4.1 HRCA 技术种属间特异性检测 增条带无明显差异，表明 HRCA 技术的稳定性
如图 7a 所示，HRCA 技术的 PLP 具有高度特 较好。
异性，仅对 10 fmol/L 二尖梅奇酵母的 ssDNA 产生 2.6 对实际样本的检测
扩增反应，对高于其 100 倍浓度的其他 11 种物种 2.6.1 HRCA 技术对实际样本的检测灵敏度
均无扩增。 如图 9a 所示，HRCA 技术可成功检测到患病
2.4.2 HRCA 技术碱基错配特异性检测 的中华绒螯蟹肝胰腺 DNA 的梯状条带，而健康蟹
如图 7b 所示，HRCA 技术仅对靶标具有明显 的肝胰腺 DNA 无条带产生。结果表明，本研究建
的扩增条带，对其他任一碱基突变的核酸均未见扩 立的 HRCA 技术可以实现对实际样品的检测。
增条带。结果表明，该检测技术能够准确识别单个 以提取的肝胰腺 DNA（4.13×10 pg/μL）为模
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碱基的错配。 板进行实际样本灵敏度的检测，结果如图 9b 显
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2.5 HRCA 技术的重复性与稳定性 示。当靶标 DNA 模板浓度为 4.13×10 、4.13×10 2
在相同试验条件下，由 3 名不同的操作人员 和 4.13×10 pg/μL 时，均可见明亮清晰和扩增条
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0
进 行 HRCA 对 二 尖 梅 奇 酵 母 靶 标 DNA 的 扩 增 带；当靶标 DNA 模板浓度为 4.13×10 pg/μL 时，
检测，结果如图 8a 所示，3 位操作人员扩增的 条带亮度极为微弱；而当靶标 DNA 模板浓度低于
电泳条带无差异，扩增条带清晰，表明 HRCA 4.13×10 pg/μL 时，均无扩增产物。因此，HRCA
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技术的重复性良好。HRCA 技术的稳定性评估结 对二尖梅奇酵母的检测限为 4.13×10 pg/μL。