Page 148 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 魏 华等： 基于超分支滚环扩增技术对中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的高灵敏检测 689

a) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 b) M 1 2 3 4 5
长度/bp 长度/bp
Length Length
500
400
300
200 500
150 400
100 300
200
50 150
100
50
图 7 HRCA 技术的特异性
Fig. 7 Specificity of HRCA

注：a. HRCA 技术种属间特异性检测（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：M. bicuspidate；泳道 2：M. agaveae；泳道 3：
M. zobellii；泳道 4：C. oleophila；泳道 5：C. opuniae；泳道 6：V. alginolyticus；泳道 7： CyHV-3；泳道 8：GCHV；泳道
9：H. eriocheir；泳道 10：Hematodinium sp.；泳道 11：P. putida；泳道 12：阴性） ； b. HRCA 技术碱基错配特异性检测
（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：靶标 ssDNA；泳道 2：S1；泳道 3：S2；泳道 4：S3；泳道 5：阴性） 。
Notes: a. HRCA inter species specificity detection map (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: M. bipipidate; Lane 2: M. agaveae;
Lane 3: M. zobellii; Lane 4: C. oleophila; Lane 5: C. opuniae; Lane 6: V. alginolyticus；Lane 7: CyHV-3; Lane 8: GCHV; Lane 9:
H. eriocheir; Lane 10: Hemodonium sp.; Lane 11: P. putida; Lane 12: Negative); b. HRCA base mismatch specific detection diagram
(M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: Target ssDNA; Lane 2: S1; Lane 3: S2; Lane 4: S3; Lane 5: Negative).

a) M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M 9 10 11 12 b) M 1 2 M 3 4 M 5 6
长度/bp 长度/bp
Length Length
500
400 500
300 400
200
150 300
100 200
50 150
100
50

图 8 HRCA 技术的重复性（a）与稳定性（b）
Fig. 8 Repeatability (a) and stability (b) of HRCA
注：a. HRCA 技术重复性分析（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1~4：操作人员 1；泳道 5~8：操作人员 2；泳道 9~12：
操作人员 3；泳道 4、8、12：阴性） 。b. HRCA 技术稳定性分析（M：DL 500 DNA Marker；泳道 1：24 h；泳道 3：48 h；
泳道 5：72 h；泳道 2、4、6：阴性） 。
Notes: a. HRCA repeatability analysis (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1−4: Operator 1; Lane 5−8: Operator 2; Lane 9−12:
Operator 3; Lane 4, 8, 12: Negative). b. HRCA stability analysis (M: DL 500 DNA Marker; Lane 1: 24 h; Lane 3: 48 h; Lane 5: 72 h;
Lane 2, 4, 6: Negative).
2.6.2 qPCR 技术对实际样本的检测 R 为 2 0.997 2（图 10b） 。qPCR 技术的扩增效率为
如图 10a 所示，用 qPCR 技术对提取的中华绒 95.45%，熔解曲线均一性良好，如图 10c 所示。
螯蟹肝胰腺 DNA 进行检测，DNA 模板浓度设置 采用 HRCA 技术和 qPCR 技术分别对随机抽
2
0
1
3
为 4.13×10 、4.13×10 、4.13×10 、4.13×10 、4.13× 取的 80 只中华绒螯蟹肝胰腺 DNA 进行检测，结
10 、4.13×10 、4.13×10 pg/μL，其中 4.13×10 、 果如表 5 所示，HRCA 技术共检测出 45 只为病蟹，
−3
−1
3
−2
2
0
−1
1
4.13×10 、4.13×10 、4.13×10 、4.13×10 pg/μL 均 检出率为 56.25%，与 qPCR 技术检测结果一致。
能检测到荧光信号。当 DNA 模板浓度为 4.13×
3 讨论
−1
10 pg/μL 时，仍然能够检测到“S”型扩增曲线且 Ct
值接近 30。对该 DNA 模板的浓度和反应循环数作 3.1 HRCA 检测方法的优势
图，呈现出良好的线性关系：y=−3.436 13x+38.119 90， 分子生物学的核酸检测技术具有诸多优点，如