Page 150 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 魏 华等： 基于超分支滚环扩增技术对中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的高灵敏检测 691

等 [28] 通过设计蛋白基因序列，用 qPCR 技术对二 分析。本研究结果表明，在扩增温度为 63 ℃ 时，
尖梅奇酵母进行检测，检测灵敏度为 11.3 拷贝/µL。 条带最为清晰，而低于此温度，则条带亮度变弱、
基于 PCR 技术可用于表征病原体，而不能用于定 不清晰，或没有条带。而且 63 ℃ 能使环化的
量，因此在实际操作中，其均会不同程度地产生假 PLP 进行 HRCA，并获得大量 HRCA 产物，因此
阳性。若要对不同病原同时检测，则需要进行多 该检测体系无需热循环设备，保持 63 ℃ 恒温即可
重 PCR，引物之间可能会互相影响而降低扩增效 完成扩增反应。在水产基层或池边检测中，利用水
率。而在本研究 HRCA 技术中，其 PLP 的 5’和 3’ 浴锅或热水袋即可完成操作，提升了便捷性。
末端以首尾相接的方式与待测靶序列完全互补，且 完全环化的 PLP 具备进行 HRCA 反应的能
只有在其 2 个末端与靶标模板形成 Watson-Crick 碱 力。PLP 的 5’和 3’端碱基序列称为结合区，可以
基对时，才能够连接并发生环化，实现了 PLP 只 与检测靶标特异性结合，从而具有较高的检测特异
与 相 应 的 靶 位 点 进 行 互 补 结 合 ， 即 使 有 多 个 性。中间序列与靶标的检测无关，通常用于设计引
PLP 同时存在于 1 个检测体系中也不会相互干扰， 物的结合位点，称为引物区。然而，这段序列必须
从而避免了对检测模板的富集，以及能够极大限度 选择与检测靶标无同源性的物种基因序列进行设
地避免假阳性，也能够减少实际样本检测中其他抑 计，常选取质粒或亲缘关系较远的物种保守蛋白基
制因子或核酸对检测结果的干扰，从而有助于提高 因。本研究中，选用 pNAK1 质粒的部分序列作为
检测灵敏度。 连接序列，设计了 PLP 两个末端上的检测序列，
在灵敏度检测中，本研究建立的 HRCA 技术 使之与二尖梅奇酵母的 26S rRNA 基因序列完全互
对 二 尖 梅 奇 酵 母 ssDNA 标 准 品 的 检 测 限 低 至 补，毗邻配对，而与其他菌种的 DNA 序列不互
0.50 fmol/L；对实际样品的检测灵敏度为 4.13× 补，从而确保 PLP 只能与二尖梅奇酵母的 DNA 序
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10 pg/μL。与 Xing 等 [13] 、Liu 等 [28] 和 Bao 等 [12] 列杂交。研究结果表明，HRCA 技术具有较高的种
利用不同的基因序列或特异性引物建立的检测二尖 属间特异性和单碱基错配性。
梅奇酵母的 PCR 方法相比，本检测方法的灵敏度 PLP 浓度过高或过低均会对 HRCA 反应产生
高于 qPCR（Xing 等 [13] 、Liu 等 [28] ）和巢式 PCR 影响，其浓度过高可能产生非特异性结合和背景信
（Bao 等 [12] ） ，且可满足水产样本池边检测的定性 号，影响检测的准确性和灵敏度，而浓度过低可能
和定量需求。 无法充分地与靶标序列进行结合，从而影响扩增效
为验证本研究建立的 HRCA 技术的特异性， 果。Szemes 等 [30] 的研究显示，线型 PLP 在连接酶
一方面，本研究将 11 个不同物种与二尖梅奇酵母 的催化作用下形成环型 PLP 后才能进行有效扩
的靶标序列进行比对后，选取特异性序列进行 增，但其中待测的靶标较少，并且会有部分线型
HRCA 扩增，结果显示 HRCA 技术仅特异性扩增 PLP 不能完全环化，对扩增产物产生背景信号，影
浓度为 10 fmol/L 的二尖梅奇酵母靶标，而对更高 响灵敏度，因此需要去除线型 PLP。核酸外切酶Ⅰ
浓度如 1 000 fmol/L 菌株均无扩增反应；另一方 和核酸外切酶Ⅲ对 ssDNA 具有高度特异性，分别
面，本研究设计将待测靶标 DNA 序列进行不同数 具有作用于 ssDNA 的 5’→3’和 3’→5’核酸外切酶
量的碱基突变，该检测方法仅对检测靶标具有特异 活性。本研究中，在连接反应后利用核酸外切酶Ⅰ
性扩增，而对包含任一突变碱基的序列均无扩增， 和核酸外切酶Ⅲ进行外切反应，去除反应体系中多
即该方法能够准确识别单个碱基的错配，这与 余的 ssDNA，降低背景信号。赵玉然等 [23] 的研究
Wei 等 [29] 发现的结合哑铃探针和 RCA 的 C2C 策 显示，4 pmol/L~1 μmol/L 为探针的适宜浓度，可
略，RCA 技术能够检测 microRNA let-7 家族成员 以保证 HRCA 反应的正常进行，并得到可靠且稳
的特异性等结果相似。以上均证实本研究设计的 定的结果。在本研究中，经条件优化后，确定的
PLP 具有高特异性。 PLP 最佳浓度量为 1 μmol/L，与赵玉然等 [23] 的研
3.2 HRCA 检测体系的优化及建立 究结果一致。
HRCA 受到扩增温度、扩增时间和 Bst DNA 3.3 HRCA 检测体系在实际样本检测中的应用
聚合酶浓度的影响。HRCA 扩增温度是由 Bst DNA 对于 RCA 反应，检测靶标需要 ssDNA，而生
聚合酶的最适反应温度决定的，而 Bst DNA 聚合 物体中的 DNA 都是以双链形式存在。获取 ssDNA
酶的反应温度范围较为广泛，因此对其进行了优化 的方式主要有 aPCR 技术和逆转录法。aPCR 技术