Page 190 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 水 产 学 报 50 卷

小死金颗粒，并采用 Nanodrop 2000 超微量分光光 烘干 30 min 后，滴加金标蛋白溶液孵育 10 min，
度计 (Thermo Fisher，美国) 在 350~650 nm 波长范 37 ℃ 烘干 30 min，密封 4 ℃ 保存作为金标垫；使
围内扫描吸光度，记录光谱特征。 用 Tris-HCl 缓冲液 (0.01 mol/L，pH 7.4，上海生工
生物工程技术服务有限公司) 浸泡玻璃纤维素膜
1.5 胶体金标记单克隆抗体
1 h，37 ℃ 烘干 30 min 后，采用 XYZ 三维划膜喷
胶体金标记抗体最适 pH 的确定 向 8 支
金仪 (上海金标生物科技有限公司，中国) 以 2.6
含 1.4 mL 的 20 nm 胶体金溶液的离心管中分别加
mg/mL 的 VP35#18 标记 T 线，1 mg/mL 的羊抗鼠
入适量 25 mmol/L K CO (pH 7.0~7.5；阿拉丁生化 IgG 标记 C 线，密封于 4 ℃ 保存备用 (图 1-a) 。
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科 技 股 份 有 限 公 司 ， 中 国 ) ， 构 建 pH 值 为 采用贴板机 (上海金标生物科技有限公司) 将处理
5.5~9.0 的等差梯度 (梯度间隔 0.5，n=8)；每管 好的样品垫、金标垫、玻璃纤维素膜和吸水垫 (上
加入 2 μL VP35#8 抗体 (2.6 mg/mL) 后涡旋振荡混 海捷宁生物科技有限公司) 按序组装于底板，随后
匀 ， 静 置 1 h； 随 后 加 入 20 μL 10% NaCl 溶 液 使用裁条机 (上海金标生物科技有限公司) 将其裁
(Sigma-Aldrich，美国) ，振荡混匀后静置 1 h，于 剪为单支宽度 4.5 mm 试纸条，加入干燥剂与样本
350~650 nm 波长范围内测定吸光度，以 520 nm 提取液 (含 0.5% 水杨酸钠、1% Tris、0.1% Tween-
吸光度峰值最高的实验组对应 pH 值作为抗体标 20，pH 8.0，阿拉丁生化科技股份有限公司) 密封
记的最佳 pH 条件。 后 4 ℃ 保存即得成品 GCRV-II 抗原检测试剂盒
胶体金标记抗体最适添加量的确定 将 (图 1-b) 。
8 管 1.4 mL 的 20 nm 胶 体 金 溶 液 经 25 mmol/L GCRV-II 抗原检测试剂盒检测时间确定
K CO 溶液 (pH 7.0~7.5) 调节至优化 pH 后，分 在室温检测过程中，捕获抗体-检测抗体的复合
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别添加 VP35#8 单克隆抗体 (2.6 mg/mL) 建立 0~ 物稳定性受反应时间影响，可能导致显色度随检
1.2 μL 等差浓度梯度 (梯度间隔 0.2 μL，n=7) ，涡 测时长产生动态变化 。为精准确定本试剂盒的
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旋混匀后室温静置 1 h；再加入 20 μL 10% NaCl 最佳反应时间，本研究设计了梯度时间实验。以
溶液，振荡混匀后静置 1 h，于 350~650 nm 波长 检测时长每间隔 5 min 为 1 组，设置 5 组实验组
测定吸光度，以 520 nm 吸光度峰值最高的实验组 (5~25 min) ，统计每组检测条件下 3 次灰度值相
对应的抗体添加量作为抗体标记的最适添加量。 对标准偏差 (RSD) 结果，并根据 RSD 统计结果确
胶体金标记 VP35#8 单克隆抗体 将 8 mL 定最适反应时间。
的 20 nm 胶体金溶液经 25 mmol/L K CO 溶液 (pH 1.7 GCRV-II 抗原检测试剂盒性能测试
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7.0~7.5) 调节至优化 pH 后，加入胶体金体积对应
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量的 VP35#8 抗体，随后以 5% BSA (阿拉丁生化 灵敏度验证 将 GCRV-YX246 (7.85×10 拷
科技股份有限公司，中国) 封闭非特异性结合位点， 贝/μL) 用 PBS 缓冲液进行连续倍数稀释 (2、4、6、
各步骤均经 3 min 涡旋混匀及静置平衡处理。最 8、10 倍) ，经涡旋振荡混匀 30 s 后，取 40 μL
终金标复合物经 4 ℃、8 000 r/min 离心35 min 纯 原液及各稀释浓度样本使用抗原检测试剂盒进行
化，沉淀复溶于 1 mL 含 1% BSA 与 5% 海藻糖的 检测，根据 T 线显色度评价抗原检测试剂盒灵敏度。
0.01 mol/L PBS (pH 7.4，Merck KGaA，德国) ，保 特异性验证 取 40 μL PBS、健康草鱼组
存于 4 ℃ 备用。 织匀浆、SVCV、CyHV-3 及 GCRV-I 病毒液，使
用抗原检测试剂盒进行平行检测， 观察 T 线是
1.6 GCRV-II 抗原检测试剂盒的组装与优化
否 出 现 条 带 ， 判 定 试 剂 条 能 否 检 测 到 SVCV、
GCRV-II 抗原检测试剂盒的组装 试纸 CyHV-3 及 GCRV-I。
条处理步骤：将玻璃纤维素膜 (上海捷宁生物科技 稳定性验证 将试纸条放置在 37 ℃ 烘箱
有限公司) 置于 PBS (0.01 mol/L，含 0.4% Triton X- 中进行加速破坏实验，每隔 15 天取出 2 个速测卡
100，pH 7.4，北京索莱宝科技有限公司) 中浸泡 1 h， 检测 GCRV-II 病毒液和健康鱼体组织匀浆。实验
经 37 ℃ 烘箱烘干 30 min 后制得预处理样品垫； 持续 90 d (等同于 4~25 ℃ 环境下储存 12 个月 ) ，
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使用 PBS 缓冲液 (0.01 mol/L，含 4% Tween-20、 共计读取 7 次检测结果并拍照记录，观测 GCRV-
10% 海藻糖，pH 7.4) 浸泡玻璃纤维膜 1 h，37 ℃ II 抗原检测试剂盒是否正常工作。

https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
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