Page 188 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 水 产 学 报 50 卷

在产业规模持续扩张的同时，集约化养殖 CRISPR-Cas12a 系统虽特异性强，但反应体系优化
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模式带来的生态压力导致病害问题日趋凸显。 门槛较高，限制了推广 。此外，就养殖场实际
其中草鱼出血病 (grass carp hemorrhagic disease， 条件而言，操作人员专业素养及仪器配置难以满
GCHD) 作为国家二类动物疫病，已成为制约产业 足现场快速诊断需求 。因此，亟需开发一种操
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健康发展的首要生物安全威胁 。2024 年中国水 作简易、结果可视化且设备普适的新型检测技术，
生动物卫生状况报告表明，在 9 种重点监测水生 以建立适用于我国水产养殖现状的快速诊断体系。
动物疫病中，草鱼出血病阳性检出率显著高于其 胶体金免疫层析技术 (CGIC) 是一种基于抗
他疫病 ，其中广西为最严重的核心疫区，阳性 原-抗体特异性结合的快速检测方法，近年来在水
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样本检出率高达 48.1% 。草鱼出血病主要由草鱼 产品质量安全检测领域得到了广泛应用 。Zhang
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呼肠孤病毒 (grass carp reovirus, GCRV) 感染引起。 等 [18] 利用光杆菌 (Photobacterium beijerinck) 的单
GCRV 依据基因组序列和血清学差异主要分为三 克隆抗体开发了基于双抗体夹心原理的胶体金免
种基因型：GCRV-I 型 (代表株如 GCRV-873) ，致 疫层析试纸条，可短时间内实现光杆菌的快速检
病性中等，主要靶器官为肠道；GCRV-II 型 (代表 测。Meng 等 [19] 以 EhSWP3 作为抗原靶标开发了
株如 GCRV-HZ08、 GCRV-104) ，是致病性最强、 一套 EHP 的 CGIC 现场检测工作流程，检测准确
流行最广的优势基因型，主要侵染鳃、肌肉和免 率高达 90%。Zhou 等 [20] 建立并优化了用于检测培
疫器官；GCRV-III 型 (代表株如 GCRV-GD108， 氟沙星 (PEF) 的快速胶体金免疫层析法，大幅降
GCRV-109) ，致病性相对较弱，主要影响肝脏等 低了水产品药物残留检测的难度。以上研究表明，
内脏器官。其中，GCRV-II 型是危害草鱼养殖的 胶体金免疫层析技术凭借其快速、灵敏和低成本
主要流行病原，主要感染体长 2.5~15.0 cm 的幼鱼， 的优势，已成为水产病原和水产品安全检测的重
临床表现为鳃盖、鳍基及肌肉组织弥散性出血， 要工具 ，为保障水产养殖的可持续发展和水产
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死亡率高达 85% 以上 。 品质量安全提供了高效解决方案。
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GCRV-II 基因组由 11 条双链 RNA 片段组成， 本研究利用实验室前期制备的 VP35 单克隆
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编码病毒结构蛋白或非结构蛋白 。分子生物学 抗体，成功研制出 GCRV-II 抗原检测胶体金试剂
研究表明，其 S11 片段编码的 VP35 蛋白位于病 盒。通过优化标记 pH 值与包被工艺，可实现 10 min
毒外衣壳 ，通过参与宿主细胞吸附及病毒粒子 快速检测，特异性强且操作简单，结果可视，灵
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装配等过程，在病毒感染过程中发挥关键作用 。 敏度高，为我国草鱼出血病现场诊断提供有效的
最新研究表明，基于 S11 片段开发的 DNA 疫苗和 技术手段，为构建“检测-预警-免疫防控”三位一体
重组亚单位疫苗，可显著诱导宿主的特异性免疫 的疫病防控新模式提供关键技术支撑。
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应答 。在本研究团队前期工作中，Lu 等 [10] 成功
1 材料与方法
获得了 VP35 单克隆抗体 VP35#8 和 VP35#18，可
特异性识别 GCRV-II 病毒颗粒，为本研究病原检
1.1 实验材料
测技术的研发奠定了基础。
疫病快速检测技术是水产病害防控的核心环 实验动物、细胞及毒株 草鱼来源于广
节，其检测结果对疫病预警和防治具有重要指导 西宏泰水产良种场，稀有鮈鲫 (Gobiocypris rarus)
意义 [11] 。目前，GCRV-II 检测主要依赖实时荧光 由 国 家 水 生 生 物 种 质 资 源 库 提 供 。 GCRV-II
定量 PCR 技术 (RT-qPCR) 、环介导等温扩增技术 (GCRV-YX246) 由中国科学院武汉水生生物研究
与横向流动试纸条技术 (LAMP-LFD) 、重组酶介 所 徐 镇 教 授 团 队 提 供 。 SVCV 、 CyHV-3 [23] 和
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导等温核酸扩增技术 (RAA) 、CRISPR-Cas12a 系 GCRV-I [24] 保存于本实验室。人胚胎肾细胞 293
统及重组酶聚合酶扩增 (RPA) 等技术 。尽管这 (HEK293T) 、质粒 pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-VP35、
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些方法灵敏度较高，但普遍存在操作复杂、耗时 pcDNA 3.1-VP7 及 VP7#12、VP35#8、VP35#18 抗
长 (如 qPCR 需核酸提取、反转录等步骤) 及设 体由本实验室提供并保存 [10,24] 。本研究获得了上海
备 依 赖 性 强 等 诸 多 局 限 [13] 。 例 如 ， LAMP-LFD 海洋大学实验动物管理和使用伦理委员会批准
技术中，其引物设计复杂且易受样本干扰 [14] ； (SHOU-DW-2021-027)，实验过程中操作人员严格

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