Page 189 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 吴海霞，等：草鱼 GCRV-II 抗原检测胶体金试剂盒研发与应用 50 卷

遵守上海海洋大学伦理规范，并按照上海海洋大 抗荧光猝灭剂 (北京索莱宝科技有限公司，北京)
学伦理委员会制定的规章制度执行。 进行封片，在 Leica SP8 激光共聚焦显微镜 (Leica，
德国) 下观察并拍照。
1.2 GCRV-II 感染实验
VP35#8 单克隆抗体特异性验证 VP7 是
采用 3 月龄、体长 2~3 cm 的稀有鮈鲫和 2 月
GCRV-I 外衣壳蛋白，本实验选择 VP7#12 抗体辅
龄、体长 4~5 cm 的草鱼作为实验动物。将实验鱼
助验证 VP35#8 抗体对 GCRV-II 的特异性识别能
置于 (28.0±0.5) ℃ 水箱中暂养 3 d 并禁食，随机分为 力 。将状态良好的 HEK293T 细胞置于无菌盖玻
[24]
感染组和对照组 (每组 n=30)。感染前，将鱼转移至含
片 的 6 孔 板 中 培 育 ， 每 孔 含 2 mL 10% DMEM
MS-222 (100 mg/L；Sigma-Aldrich，美国) 的麻醉 培养基 (Thermo Fisher，美国) 。待细胞覆盖率达
[25]
水体中，待鳃盖运动明显减缓后 ，进行腹腔注
90%， 使 用 jetOPTIMUS 试 剂 盒 分 别 将 质 粒
射，稀有鮈鲫感染组注射 15 μL GCRV-YX246 病
pcDNA 3.1、 pcDNA 3.1-VP35、 pcDNA 3.1-VP7
2
毒悬液 (7.04 × 10 拷贝/μL) ，对照组注射等体积 转染至 HEK293T 细胞。48 h 后，用 PBS 清洗盖玻
磷酸盐缓冲溶液 (PBS) (上海生工生物工程技术服 片，用 2 mL 4% 多聚甲醛固定细胞 20 min；用
务有限公司，中国) ；草鱼感染实验则采用灌胃感 PBS 洗涤盖玻片 2 次 (1 min/次) 去除多余的多聚甲
染方式，用病毒悬液润湿灌胃管后沿口腔中线缓 醛，将盖玻片完全浸入免疫染色通透液 (上海碧
慢插入至胃部，灌胃 100 μL 病毒悬液，对照组灌 云天生物技术有限公司) ，室温下放置10 min。弃
胃等体积 PBS。感染后将实验鱼暂养在恢复缸中 去通透液，用 PBS 重复清洗 2 次盖玻片 (1 min/次) ，
恢复，再转移至 28 ℃ 恒温水体中，每日观察记录 使用含 5% BSA 的 PBS 以 1∶400 的比例稀释一抗
感染症状 (包括体表点状出血、鳍基充血和游动异 (VP35#8-CY5) 和二抗 (VP7#12-FITC)。沿 6 孔板
常等) 及死亡情况 ，出现典型症状时进行取样。 孔壁加入一抗稀释液直至盖玻片完全浸没，室温
[26]
1.3 VP35 单克隆抗体验证 下孵育 6 h 后沿孔板边缘加入 PBS 清洗 3 次 (5 min/
次)，去除多余一抗溶液。以上述相同步骤孵育二
VP35#8 与 VP35#18 为特异识别 GCRV-II 外
抗后经 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚核染 10 min 并使
衣壳蛋白 VP35 的两株不同抗原表位单克隆抗体，
用 PBS 缓冲液清洗 3 次，在避光环境下滴加 5 μL
本实验室前期研究表明，VP35#18 抗体能够特异
抗荧光猝灭剂进行封片，在激光共聚焦显微镜下
[10]
识别 VP35 蛋白 。本实验开展了对 VP35#8 单克
进行多通道荧光成像。
隆抗体的靶标结合特异性验证，进一步确认其作
为捕获抗体的适用性。 1.4 胶体金的制备及表征分析
VP35#8 单 克 隆 抗 体 结 合 力 验 证 取 胶体金溶液制备 采用柠檬酸三钠还原
GCRV-II 感染稀有鮈鲫的鳃、肝脏及脾脏组织， 法制备 20 nm 胶体金 [27] 。取 100 mL 超纯水置于
经 4% 多聚甲醛 (北京索莱宝科技有限公司，中 200 mL 锥形瓶中，使用磁力搅拌加热器 180 ℃，
国) 于 4 ℃ 固定 12 h 后，进行梯度脱水处理： 200 r/min 加热至沸腾，向沸水中迅速加入 100 μL
10%、20% (体积质量比) 蔗糖溶液逐级浸泡，每 10% 氯金酸溶液 (Sigma-Aldrich，美国) ，保持持
个浓度处理 12 h 并进行 3 次重复脱水处理。脱水 续沸腾 5 min。随后，一次性加入 2 mL 的 1% 柠
样本经包埋后，利用冰冻切片机 (Leica CM1950， 檬酸钠溶液 (阿拉丁生化科技股份有限公司，中
美国) 制备组织切片。切片于 37 ℃ 烘干脱水 1 h， 国) ，观察溶液颜色变化，待反应体系颜色稳定后
4 ℃ 条件下经 PBS 复水，随后置于柠檬酸钠缓冲 继续加热 10 min，随后停止加热，自然冷却至室
液 (0.01mol/L) 中 80 ℃ 水浴 10 min。待自然冷却 温，用超纯水定容至 100 mL，获得粒径约 20 nm
后用 PBS 清洗 3 次 (5 min/次) ，3% BSA 封闭 1 h 的胶体金溶液。
后 清 洗 3 次 。 将 切 片 与 FITC 偶 联 的 VP35#8 胶体金溶液质量鉴定 20 nm 胶体金溶液
(FITC-VP35#8) 于 4 ℃ 避 光 孵 育 过 夜 ， 随 后 用 制备工艺较为成熟，已有研究公开 20 nm 胶体金
PBS 洗涤 3 次 (5 min/次) 。最后经 4′,6-二脒基-2-苯 粒子电镜图，本实验仅进行胶体金溶液视觉效果
[28]
基吲哚 (Sigma-Aldrich，美国) 孵育 10 min 进行细 鉴定与光谱特征评估 。取 10 mL 胶体金溶液置
胞核染色，经 PBS 清洗后在避光条件下滴加 5 μL 入玻璃试管中，对光观察溶液色泽及有无黑色细

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